甲潑尼龍對高糖腹膜透析液誘導人腹膜間皮細胞表達纖維化相關細胞因子的影響

蔡家駒，戴衛波，吳惠妃，葉秋明，蕭俊祺

中山市中醫院臨床藥學室，廣東中山，528400

腹膜透析（PD）是終末期腎病（ESRD）患者首選的腎臟替代治療方法之一，然而，PD 常用的高濃度葡萄糖腹膜透析液（PDS），由于具有明顯的生物不相溶性，長期應用可致人腹膜間皮細胞（HPMCs）損傷，增殖受抑，并產生炎癥因子和促纖維化因子，促進細胞外基質（ECM）增生及上皮間充質轉化（EMT），從而引起腹膜纖維化（PF）［1］。目前對此仍缺乏有效的防治方法。甲潑尼龍（MP）屬于糖皮質激素（GCs），具有良好的抗炎、抑制成纖維細胞增生及拮抗膠原合成等作用，可用于治療以增生為主的慢性炎癥，如特發性腹膜后纖維化、肺間質纖維化。但關于MP在PF中的應用研究鮮有報道。為了探討MP 潛在的抗PF 機制，本研究觀察了MP 對HPMCs在高糖PDS孵育下的增殖活性及其所表達的一系列細胞因子影響，包括活性氧（ROS）、白細胞介素6（IL-6）、核轉錄因子（NF-κB）、轉化生長因子 β1（TGF-β1）、結締組織生長因子（CTGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、透明質酸（HA）、Smads 蛋白等，以其為PF 治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞與藥物：人腹膜間皮細胞（HPMCs）購自廣州博奧新生物科技有限公司；4.25%葡萄糖腹膜透析液購自廣州百特醫療用品有限公司；甲潑尼龍（abs47047661）購自愛必信（上海）生物科技有限公司。主要試劑：DMEM 培養基（C12430-062）、胎 牛 血 清（C2027050）、TRIzol（10296-028）、SYBR GREEN qPCR Super Mix（C11733046）購自 Invitrogen 公司；RPMI1640 培養基（SH30809.01B）購自 Hyclone 公司；CCK-8 試劑盒（CK04）、MTT 溶液（M1025）購自北京索萊寶科技有限公司；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司合成）；BCA 法蛋白含量檢測試劑盒（KGPBCA）購自南京凱基生物發展有限公司；Anti-NF-κB p65抗體（ab16502）、Anti-TGF-β1抗體（ab92486）、Anti-CTGF 抗 體 （ab6992）、Anti-VEGF 164 抗 體（ab53465）、Anti-Smad2 + Smad3 抗體［EPR19557］-ChIP Grade（ab207447）、Anti-Smad2 + Smad3（phospho T8）抗體（ab272332）、Anti-MADH7/SMAD7 抗體（ab90086）購自Abcam 公司。主要儀器：實時定量 PCR 儀（Applied Biosystems，ABI PRISM? 7500 Sequence Detection System）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，Tanon-1600）；水平電泳槽（上海天能科技有限公司，HE-120）；核酸蛋白測定儀（Eppendorf，22331 Hamburg）；酶標儀（Therom scientific，3530910449）；電泳儀（北京百晶生物技術有限公司，BG-Power 600i）；垂直電泳槽（上海天能科技有限公司，VE180）；轉移電泳槽（上海天能科技有限公司，VE186）；流式細胞儀（BD FACS Calibur）；細胞恒溫培養箱（Thermo scientific，311）。

1.2 細胞培養 HPMCs 單細胞懸液接種于25 cm2的培養瓶中，以含 10%FBS、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM 培養液作為培養基，放入37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養箱進行培養，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞存活率的測算 采用CCK-8 法檢測。用含10%FBS 的RPMI1640培養液配成單細胞懸液，接種于96 孔板，每孔體積100μL。培養24 h 后，加入不 同 濃 度（0.032、0.064、0.128、0.256、0.512、1.024μg/mL）的MP，每個濃度設置8個復孔。處理細胞 48 h 后，棄含藥培養基，每孔加入 10 μL 的CCK-8 溶液，培養4 h 后，用酶標儀測波長為450 nm的各孔光吸收值（OD）。細胞存活率=（不同MP濃度的OD 均值-空白組OD 均值）/（對照組OD 均值-空白組OD 均值）×100 %，計算MP 各濃度下的細胞存活率，然后用GraphPad Prism 8 繪制存活率曲線圖，并計算半抑制率（IC50）。

1.4 各組細胞增殖活性檢測 采用MTT 法。用胰蛋白酶/EDTA 溶液消化，制成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔體積200μL，每組設置3個復孔。隨機分為空白組（含10% FBS 培養液）、模型組（含4.25%PDS 和 10%FBS 培養液）和 MP 低、中、高劑量組（含MP濃度為0.1、0.2、0.4μg/mL的4.25%PDS和10%FBS 培養液），分別培養0、24、48、72 h，每孔加入20 μL 的 MTT 溶液（5 mg/mL），孵育4 h后終止培養，吸棄孔內培養上清液，加150 μL 的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm 波長，用酶標儀測定各孔 OD 值，以 OD 值表示各組細胞的增殖活性。

1.5 活性氧（ROS）檢測 制備單細胞懸液，接種于6 孔板上，培養24 h 后，吸去培養液，用無血清培養基按照1∶1 000 稀釋成終濃度為50 μmol/L的二氫乙啶（DHE）染色液加入細胞中，在37 ℃細胞培養箱中避光孵育30 min。將DHE 溶液棄掉，用PBS 緩沖液沖洗3 次，以充分去除未進入細胞內的DHE 溶液。重懸成單細胞懸液，使用流式細胞儀檢測細胞內的熒光強度（采用488 nm波長激發，測定565 nm 以上的發射），反映各組ROS 水平。

1.6 IL-6、α-SMA、HA 的 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄合成 cDNA。 IL-6 正 向 引 物 5'-AGTAACATGTGTGAAAGCAG-3'，反向引物3'-GATGATTTTCACCAGGCAAG-5'，片段長度126 bp；α-SMA正向引物5'-CCGCCATGTATGTGGCTATT-3'，反向引物 3'-CTTCATGAGGTAGTCGGTGA-5'，片段長度 185 bp；HA 正向引物5'-ATTATCTTCGAGTCTTCATC-3'，反向引物3'-TTATCAAGCTCATCCAGTGT-5'，片 段 長 度 108 bp；18sRNA 正向引物 5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'，反向引物3'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-5'，片段長度112 bp。反應體系：cDNA 5 μL，正反向引物各5μL，2×SYBR Green qPCR SuperMix 10μL，去離子水5 μL。反應條件：95 ℃ 預變性2 min；95 ℃變性2 min；60 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，共40個循環，采用2-ΔΔCt法分析RT-PCR結果。

1.7 各組NF-κB、TGF-β1、VEGF、CTGF、Smad 2/3、p-Smad 2/3、Smad 7 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。 冰上裂解細胞，4 ℃，14 000 r/min 離心5 min，離心半徑3 cm，留取上清用BCA 法檢測樣品蛋白濃度。將樣品蛋白溶液于10% SDSPAGE 電泳分離，電轉移至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h 后，一抗敷育4 ℃過夜，TBST 漂洗4 次后，加入辣根堿過氧化物酶標記的二抗稀釋液37 ℃孵育1 h，洗膜，于PVDF 膜上滴加ECL 顯影液，掃描儀成像分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，組間比較采用重復測量方差分析及單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MP 對HPMCs 存活率的影響 不同濃度的MP 處理HPMCs 48 h 后，各孔細胞存活率見表1。與未加藥組比較，MP 濃度在0.032～0.256 μg/mL時，HPMCs 存活率升高（P＜0.05）；而當 MP 濃度≥0.512 μg/mL 時，HPMCs 存活率受到抑制（P＜0.05）。使用 GraphPad Prism 8 計算 MP 的 IC50為0.842 μg/mL。

表1 不同濃度MP干預下的HPMCs存活率比較

2.2 各組不同培養時間HPMCs 增殖活性比較 見表2。

表2 不同培養時間的HPMCs增殖活性（）

表2 不同培養時間的HPMCs增殖活性（）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與高劑量組相比，ΔP＜0.05。

組別OD值空白組模型組MP 低劑量組MP 中劑量組MP 高劑量組72 h 0.814±0.012#0.586±0.003*Δ 0.612±0.008*#Δ 0.736±0.007*#Δ 0.813±0.004#0 h 0.282±0.001 0.285±0.005 0.283±0.001 0.280±0.007 0.287±0.006 24 h 0.424±0.007#0.371±0.009*Δ 0.387±0.006*Δ 0.403±0.003#0.415±0.009#48 h 0.604±0.008#0.483±0.004*Δ 0.503±0.003*Δ 0.552±0.027*#Δ 0.601±0.002#

2.3 各組細胞內ROS、IL-6、α-SMA、HA mRNA 表達比較 見表3。

表3 各組ROS、IL-6、α-SMA、HA mRNA表達比較（）

表3 各組ROS、IL-6、α-SMA、HA mRNA表達比較（）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與高劑量組相比，ΔP＜0.05。

組別空白組模型組MP 低劑量組MP 中劑量組MP 高劑量組HA 1.00±0.02#Δ 3.01±0.07*Δ 2.04±0.04*#Δ 1.51±0.05*#Δ 1.17±0.03*#ROS（%）13.23±1.25#44.37±4.47*Δ 37.37±1.66*Δ 25.43±5.25*#Δ 15.23±1.40#IL-6 1.00±0.03#3.61±0.10*Δ 2.70±0.07*#Δ 1.77±0.05*#Δ 1.17±0.03#α-SMA 1.00±0.03#8.27±0.21*Δ 4.01±0.07*#Δ 2.57±0.08*#Δ 1.25±0.04#

2.4 各組NF-κB、TGF-β1、VEGF、CTGF、Smad 2/3、p-Smad 2/3、Smad 7 蛋白表達比較 各組Smad 2/3 表達量兩兩間比較均無統計學差異。在其他蛋白表達中，模型組表達均上調（P均＜0.05）。與空白組比較，除了MP 高劑量組表達NF-κB 無統計學差異外，其余劑量組 NF-κB、TGF-β1、VEGF、CTGF、p-Smad 2/3、Smad 7 表達均有統計學意義（P均＜0.05）；與模型組比較，各組相關蛋白表達差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表 4。

表4 各組 NF-κB、TGF-β1、VEGF、CTGF、Smad 2/3、p-Smad 2/3、Smad 7蛋白表達比較（）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與高劑量組相比，ΔP＜0.05。

組別空白組模型組MP低劑量組MP 中劑量組MP高劑量組Smad 7 0.386 ± 0.002#Δ 1.058 ± 0.005*Δ 0.936 ± 0.006*#Δ 0.684 ± 0.003*#Δ 0.487±0.002*#NF-κB 0.549±0.003#1.430 ± 0.006*Δ 0.973 ± 0.003*#Δ 0.836 ± 0.004*#Δ 0.542±0.002#TGF-β1 0.668±0.010#Δ 1.381±0.004*Δ 1.169±0.006*#Δ 1.013±0.002*#Δ 0.740±0.002*#VEGF 0.436±0.002#Δ 1.345±0.007*Δ 1.134 ± 0.005*#Δ 0.867 ± 0.003*#Δ 0.507±0.003*#CTGF 0.346±0.001#Δ 0.765±0.004*Δ 0.602±0.002*#Δ 0.473±0.002*#Δ 0.363±0.001*#Smad 2/3 1.168±0.007 1.171±0.004 1.169±0.005 1.171±0.005 1.170±0.008 p-Smad 2/3 0.389±0.002#Δ 1.091±0.004*Δ 0.936±0.004*#Δ 0.703±0.001*#Δ 0.557±0.031*#

3 討論

PF 是PD 患者的嚴重并發癥，其發生機制至今尚未被完全闡明。現有研究表明，在高糖PDS 誘導HPMCs 損傷，繼而發生 PF［2］的過程中，有多種細胞因子參與其中，如ROS、炎性因子、促纖維化因子等［1］。MP 屬于常用的糖皮質激素之一，具有明顯的抗炎和抗纖維化作用，已用于某些纖維化疾病中。本實驗結果顯示，MP 濃度在 0.032～0.256 μg/mL時，HPMCs 存活率明顯升高；MP 對 HPMCs 的 IC50為0.842 μg/mL；劑量為0.1～0.4 μg/mL 的MP 可促進高糖刺激下的HPMCs活性恢復，并呈現量效關系。

ROS是需氧細胞在代謝過程中產生的一系列活性氧簇，可引起生物膜脂質過氧化，破壞細胞的結構及功能，同時，還參與一系列促纖維化因子的信號轉導，與多種纖維化疾病相關［3］。在高糖PDS 的持續刺激下，HPMCs 線粒體可產生大量ROS，后者一方面損傷細胞，引起腹膜炎癥［4］；另一方面通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路及 TGF-β1/Smads 通路，誘導成纖維細胞的增殖和ECM的合成［5］。本研究發現，MP 在濃度為 0.2～0.4 μg/mL 時可降低 HPMCs的ROS 表達。由于ROS 可被超氧化物歧化酶（SOD）部分清除，推斷上述機制可能與MP具有調節SOD活性作用有關［6］。

IL-6 為多效性炎性細胞因子，在高糖PDS 誘導下，IL-6 在腹膜間皮細胞中表達增多［7］，并通過促進TGF-β1的產生［8］及激活 JAK2/STAT3 信號通路等機制，誘導 HPMC 發生 EMT［9］，而且，還與 IL-1、IL-18、TNF-α等炎性因子形成復雜的網絡機制，進行反饋調節［7］，影響PF的形成過程。NF-κB具有調控多種基因轉錄的功能，可促使TNF-α、IL-β1、IL-6等多種炎細胞因子的分泌和釋放，促進成纖維細胞的增殖和分化，引起纖維化疾病［10］。有學者指出，HPMCs 受到高糖PDS 的持續作用后，會上調 NF-κB 的表達，而加入NF-κB 抑制劑可阻斷 ECM 的積聚及 EMT 過程［11-12］。本實驗結果顯示，MP可減少IL-6和NF-κB表達，提示MP通過抗炎作用，抑制PF的發展。

TGF-β1是公認的強致纖維化因子。研究表明，在高糖 PDS 長期刺激下，TGF-β1的過度表達，促進膠原蛋白、纖黏連蛋白的合成，調節MMPs 及其抑制物（TIMPs）的活性，導致 ECM 過度產生，誘導HPMCs 發生EMT，從而引發PF［13］。在此過程中，α-SMA 作為EMT 的標記蛋白，與屬于ECM 基本成分之一的 HA 均會表達增強［14，7］。CTGF 和 VEGF 是TGF-β1促纖維化作用的重要下游信號蛋白。CTGF可調節細胞增殖、凋亡，促進纖維母細胞的分化、遷移與黏附，介導 ECM 沉積［14］。VEGF 能特異地作用于血管內皮細胞，促進腹膜血管生成，影響腹膜超濾功能［15］，與PF的形成存在明顯正相關［16］。本實驗證實，MP 同時下調TGF-β1、CTGF、VEGF、α-SMA、HA表達，提示MP 可使HPMCs 減少促纖維化因子的分泌、并且抑制ECM的合成及阻滯EMT發展。

Smads 蛋白是TGF-β1主要信號通路的下游因子。其中，Smad2/3 的磷酸化是 TGF-β1/Smads 信號通路被激活的標志，p-Smad2/3 的表達量反映該通路被激活的程度；Smad7 作為抑制型Smad，能反饋抑制Smad2/3 的磷酸化，進而阻斷TGF-β1介導的ECM 合成［17-18］。因此，減少 p-Smad2/3 或上調 Smad7對PF 的防治有重要意義。但本實驗發現，HPMCs在高糖PDS 的刺激下，同時上調p-Smad2/3 和Smad7的表達量，而在MP干預后，兩者又同步下調。此與部分學者的研究結果基本符合，推測Smads 信號通路中可能存在正、負反饋機制［19］。另外，有研究指出，GCs 抑制EMT 的作用并非依賴Smad2/3 的磷酸化，可能與其他信號通路有關［20］。

綜上所述，MP 可減輕高糖 PDS 對 HPMCs 的氧化應激，減少炎癥因子和促纖維化因子的生成，抑制ECM 沉積和EMT 發展，進而起到抗PF 的作用。然而，p-Smad2/3 和Smad7 表達水平的同向變化，并不能充分解釋MP 對Smads 通路的作用機制。本研究為MP 治療PF 提供了理論依據，但是否還與其他信號通路有關，仍有待更進一步研究。