TERC 與 p16/Ki-67 檢測診斷宮頸高級別上皮內瘤變效能比較

劉欣，陳少敏，高冠峰

濰坊市人民醫院婦科，山東濰坊261041

在女性腫瘤中，宮頸癌發病率較高，高危人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染是導致宮頸癌的直接病因。近年來隨著宮頸病變篩查的普及，發病率及病死率有所下降。根據國家癌癥中心2019 年全國癌癥報告，在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發病占比6.25%，居第六位；病死率占比3.96%，居第八位，均高于子宮內膜癌、卵巢癌等惡性腫瘤。根據美國癌癥學會2019 年癌癥統計，美國2019 年宮頸癌發病13 170例，死亡4 250例，宮頸癌在20～39歲女性中，病死率居第二位［1］。目前最常用的宮頸細胞學篩查存在主觀性強、重復性差、容易產生爭議結果的缺點。高危HPV 檢測作為宮頸細胞學的補充，主要推薦用于＞30歲的女性人群。但HPV 檢測特異度差，且現行檢測方法無法準確指出哪部分感染患者更易于發生宮頸癌。大量HPV 感染的婦女行陰道鏡檢查，造成了不必要的心理和經濟負擔。原癌基因的擴增，如TERC 的擴增是宮頸癌變的早期事件，診斷效能卓越［2］，但價格較高，從經濟—效能比率的因素考慮尚需改進。p16/Ki-67 免疫細胞化學檢測近年來逐步被應用于宮頸癌篩查，有較高的靈敏度和特異度，可作為宮頸高級別上皮內瘤變（CIN2+）的有效篩查手段［3］。本研究對比TERC及p16/Ki-67在宮頸細胞學標本中檢測的診斷效能，從而選取更優化的篩查策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2013 年1 月—2020 年12月于濰坊市人民醫院門診就診的宮頸液基薄層細胞學（TCT）或HPV 篩查陽性患者。納入標準：婦科門診就診病例以及機會性篩查的25～64 歲病例。排除標準：近期接受過宮頸病變治療的病例；已行陰道鏡活檢或已確診宮頸上皮內瘤變（CIN）者。共入組篩查陽性患者51 例，患者年齡（40 ± 6.5）歲。所有病例已行TCT 檢查及HPV 檢測，并經組織學證實和陰道鏡檢查。51 例患者中，組織學檢查證實正常4例，CIN1 級 12 例，CIN2 級 18 例，CIN3 級 14 例，鱗狀細胞癌（SCC）3例。細胞學診斷分布：無上皮內病變或惡性病變（NILM）7 例，非典型鱗狀上皮細胞不能明確意義（ASCUS）15 例，低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）15 例，非典型鱗狀細胞傾向高度病變（ASCH）6 例，高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）8 例。另選取10例TCT及HPV篩查均為陰性的患者作為對照，陰道鏡活檢病理或子宮全切術后宮頸病理正常。統計分析時，宮頸CIN2+級及以上視為宮頸癌前病變，CIN1-組共計26例（包含炎癥及CIN1），CIN2+組（包含CIN2、CIN3 及SCC）共計35 例。本研究開展獲醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 TERC 擴增檢測 采用熒光原位雜交（FISH）法。雙色FISH探針購自北京GP 醫療技術公司。取5 mL 剩余TCT 細胞保存液，離心后膠原酶B 溶液37 ℃消化20 min，去離子水37 ℃水浴靜置30 min。甲醇—冰醋酸固定并滴片，56 ℃烤片30 min。滴加探針混合物，75 ℃水浴鍋內共變性5 min，42 ℃雜交16 h，67 ℃下 0.3% NP-40/0.4×SSC 溶液中洗滌，70%乙醇洗滌3 min，干燥玻片后滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚，暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀察。FISH 圖像用Olympus 熒光顯微鏡，使用Video-TesT-FISH 2.0 軟件采集。信號判讀：單個細胞核中觀測到2 個紅色信號（TERC）和2 個綠色信號（CEP3）認定為正常二倍體細胞。TERC 信號＞2 個，或TERC 信號和CEP 信號比值＞1，則認定為異常細胞。觀察計數視野中的所有細胞（＞100 個），對觀察細胞中異常細胞占比進行測算。以TERC 擴增細胞≥5%為陽性閾值。

1.3 p16/Ki-67 表達檢測 采用細胞免疫化學法。取剩余TCT 標本保存液混勻2 min，吸取2 mL 入沉降制片器，靜置10 min。去除上清液，拆除制片器，將玻片稍干，95%乙醇固定10 min。鼠抗人p16 INK4a 蛋白單克隆抗體、兔抗人Ki-67 單克隆抗體、DS-0001 Polymer 雙染檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將玻片在3%H2O2孵育10 min，微波爐抗原修復，封閉液封閉10 min。加入一抗混合物，濕盒孵育。加入辣根酶標記山羊抗小鼠IgG和堿磷酶標記山羊抗兔IgG的二抗聚合物，濕盒孵育30 min。滴加DAB 工作液，鏡下觀察，約3 min。滴加 AP-Red 工作液，孵育 10 min，鏡下觀察。蘇木素復染，封片觀察。p16 陽性顯色為細胞核和細胞質的棕黃色，Ki-67 陽性顯色為細胞核紅色。在同一細胞中出現雙染提示為p16/Ki-67 陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。率的比較使用Z檢驗，四格表資料使用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線評估 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 的診斷效能。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織學類型患者TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 陽性情況比較 TERC 擴增率在CIN1-組和CIN2+組中分別為11.5%及94.3%，差異有統計學意義（P＜0.01）。p16 擴增率在CIN1-組和CIN2+組中分別為42.3%及88.6%，差異有統計學意義（P＜0.01）。Ki-67 擴增率在 CIN1-組和 CIN2+組中分別為15.4%及82.9%，差異有統計學意義（P＜0.01）。p16/Ki-67 雙染陽性在CIN1-組和CIN2+組中分別為4.0%及80.0%，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 不同組織學類型患者TCT及HPV結果、TERC擴增、p16及Ki-67表達比較（例）

2.2 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 對于 CIN2+的診斷效能比較 見表2。TERC 檢測較TCT/HPV 檢測有較高的靈敏度和特異度（94.3% vs 80.0%，88.5% vs 61.5%，P均＜0.05）。p16/Ki-67 檢測較TCT/HPV 檢測有相似的靈敏度和較高的特異度（80.0% vs 80.0%，P＞0.05；96.2% vs 61.5%，P＜0.05）。p16/Ki-67 檢測具備與 TERC 檢測較低的靈敏度（80.0% vs 94.3%，P＜0.05），略高的特異度（96.2% vs 88.5%，P＞0.05），并有相似的準確性（86.9% vs 91.8%，P＞0.05）。在各種診斷策略中，p16/Ki-67 特異度最高（96.2%），其次為 TERC（88.5%）。TERC 靈敏度最高（94.3%），其次為HPV（91.4%）。曲線下面積（AUC）最高的是TERC 檢測（AUC=0.927），其 次 為 p16/Ki-67 檢 測（AUC=0.903）。

表2 TCT及HPV結果、TERC擴增、p16及Ki-67表達對于CIN2+的診斷效能比較［%（95%CI）］

3 討論

宮頸癌目前的篩查策略以細胞學和HPV 結合為主，存在一定局限性。細胞學診斷是主觀診斷，存在靈敏度差、可重復性差的缺點，對病理學醫師的要求較高。HPV 檢測作為細胞學的補充，靈敏度高，可以彌補TCT 不足，但大量HPV 陽性結果增加了陰道鏡轉診量，造成不必要的心理負擔和經濟花費［4］。美國陰道鏡及宮頸病理學會（ASCCP）指南建議對30 歲以上女性可實施細胞學和HPV 聯合篩查。2018年美國預防服務工作小組（USPSTF）建議指出，30～65 歲的婦女應與其醫療保健專業人員討論哪種檢測策略最適合，表明在選擇特定策略時，偏好可能是重要的考慮因素。USPSTF 將單獨選擇HPV 檢測或聯合測試對細胞學策略的臨床意義總結如下：基于HPV 篩查的策略將避免每1 000 例篩查婦女中增加約1 例癌癥病例，與細胞學相比，改善非常小。然而，與僅行細胞學相比，基于高危HPV 檢測的策略將使婦女接受更多的檢查過程［5］。本研究中，以宮頸細胞學ASCUS+為閾值，靈敏度可達88.6%，但非典型鱗狀細胞（ASCUS 及ASC-H）的占比較高（21/51），特異度較差，對臨床的指導性不強。因此，需盡快找到可對宮頸癌前病變早期提示的標志物。

原癌基因擴增在高危HPV 的感染中較為常見，基因異常后引起細胞形態學異常，因此基因擴增可能是先發于形態學改變的早期事件。在宮頸癌的相關研究中，美國國家衛生研究院牽頭的研究顯示，3號染色體長臂擴增是宮頸癌變過程中不可忽視的遺傳學改變。在3號染色體中的人類染色體端粒酶基因（TERC 基因，位于3q26.3）的異常可能是造成向宮 頸 癌轉變的原 因［6］。 HESELMEYER-HADDAD等［7］通過 FISH 技術對宮頸細胞中的 hTERC 基因進行檢測，63%的CIN2 和76%的CIN3 出現了hTERC基因拷貝數的增加，并且拷貝數和病情的嚴重性呈正比，能較好地預示高度病變。對研究入組患者進行隨訪，發現hTERC 基因擴增的患者1～3 年后有40.7% 從 CIN1/2 進展到 CIN3。ANDERSSON 等［8］亦報道了宮頸腺癌中單個細胞內TERC 基因平均拷貝數為3.3（范圍為2.3～5.2）。通過熒光原位雜交法，運用熒光標記探針和樣本DNA 進行特異度雜交，利用熒光顯微鏡可以觀察到被標記的異常DNA。用FISH 檢測TERC 擴增細胞比例≥5%在診斷宮頸病變方面有較高的靈敏度和特異度，可與HPV 結合用于宮頸癌篩查［2，9］。FISH 技術操作在細胞分裂間期也可實施，無需進行細胞培養，特異度和靈敏度佳，用于臨床檢測準確可靠，缺陷是費用較高，臨床應用受限。

p16 蛋白是CDKN2A 基因（定位于9p21）編碼的相對分子質量為16 kD 的蛋白，定位于細胞核內，對CDK4/6-CyclinD／Rb-E2F 環路起負性調控作用，阻止細胞由G1期進入S 期，一旦p16 基因缺失、突變，則不能抑制CDK4，最終導致細胞進入惡性增殖［10］。研究證實，p16 過度表達與HPV 感染及宮頸病變密切相關［11-13］。Ki-67 為MKI67 基因（定位于10q26.2）編碼的核蛋白，在增殖期的細胞（G1、S、G2和M期）高表達。腫瘤分化的程度、轉移、浸潤和預后均可依據Ki-67 指數進行判斷。KRUSE 等［14］發現，宮頸病變由CIN1 向CIN2 和CIN3 進展時可以參考Ki-67指標。

p16 和Ki-67 免疫組織化學聯合檢測已常規用于宮頸病變的組織學診斷。我國《宮頸癌及癌前病變病理診斷規范》指出，p16和Ki-67可用于鑒別高級別上皮內瘤變和低級別上皮內瘤變，以及不成熟化生、修復性改變等［15］。免疫組織化學法主要用于鑒別診斷，而免疫細胞化學可將鑒別診斷前移到篩查環節，有助于宮頸病變的診斷，避免不必要的陰道鏡檢查和活檢。近年來，p16/Ki-67免疫細胞化學雙染色已逐漸開始用于宮頸病變的臨床診斷。IKENBERG等［16］報道了多中心 ASC-US 及 LSIL 基礎標志物研究（PALMS）的結果，選取了5個歐洲國家的27 349例宮頸癌篩查者進行了宮頸細胞學、HPV、p16/Ki-67細胞學雙染檢測，發現在所有年齡組中，宮頸p16/Ki-67細胞學雙染比宮頸細胞學涂片診斷CIN2+的靈敏度更高，而特異度相似。特別是在HPV 感染率高、檢測特異度差的青年女性組，p16/Ki-67細胞學雙染在宮頸癌篩查中有著高度靈敏度和良好的特異度。EL-ZEIN 等［17］報道了通過免疫染色試驗確定上皮內瘤變的篩查分診研究（STAIN-IT）的結果，從1 158例常規TCT、HPV 和活檢結果有效的標本中隨機選取492 例宮頸標本，進行回顧性p16/Ki-67 雙染色細胞學檢測，發現雙染色細胞學陽性率隨組織學嚴重程度的增加而增加，單純雙染色細胞學檢查對CIN2+的診斷靈敏度低于HPV 檢測，特異度高于HPV檢測。李雨聰等［18］研究統計，p16/Ki-67細胞學雙染對宮頸癌前病變診斷有較高的靈敏度及特異度，與本研究相符。周小會等［3］對中外12篇文獻，累計 3 696 例患者進行了 Meta 分析，p16/Ki-67 細胞學雙染檢測診斷CIN2+的合并靈敏度為88%、合并特異度為64%，認為其靈敏度中等，而特異度較高，有助于對宮頸癌篩查異?；颊叩脑\斷。p16/Ki-67 雙染對宮頸病變預后的影響亦有相關研究，CLARKE等［19］發現，在 HPV 陽性患者中，雙染陽性導致 5 年CIN2+發生率顯著升高，而陰性者發病率明顯下降，認為p16/Ki-67 雙染檢測在5 年內可提供更好的長效風險分層管理，雙染陰性者可適當延長篩查間隔。

p16/Ki-67二者結合在宮頸細胞學中的應用，可有效識別增殖細胞，有助于識別形態不典型的異常細胞或細胞團，指導診斷。但多需要專用制片儀器，如CINtec，價格昂貴，臨床使用受限。我們在實驗中發現，簡化的手工制片技巧可使試驗步驟更短，達到近似效果。本研究中，p16/Ki-67 檢測和TERC 檢測的診斷效能均優于傳統的TCT/HPV 檢測，其中p16/Ki-67 檢測比TERC 靈敏度略低，但卻有較高的特異度和相似的準確性，適合于CIN1-和CIN2+的鑒別診斷，指導異常細胞學結果的陰道鏡轉診，尤其是ASCUS 的轉診。由于TERC 檢測費用較高，且前期已針對TERC進行過大樣本的篩查病例研究［2］，故本研究病例選擇以CIN 病例為主，因此病例數偏少，以后將爭取繼續進行較大樣本的研究。p16/Ki-67 細胞化學檢測靈敏度和特異度均較高，有良好的診斷效能，操作簡便，價格低廉，是一種更適合廣泛開展的宮頸病變診斷方法。