變應性鼻炎患者血清let-7e、miR-155-5p 表達及其與Treg/Th17細胞平衡的關系

楊好喜，龔淑敏，王虹

1 南開大學附屬醫院 天津市第四醫院耳鼻喉科，天津300222；2 南開大學附屬醫院 天津市第四醫院內科

變應性鼻炎（AR）是一種主要由IgE介導的鼻變態反應性疾病，臨床主要表現為反復噴嚏、瘙癢、鼻漏、鼻塞和鼻充血，可嚴重影響生活、學習和工作［1］。免疫反應是AR 發病的病理基礎，輔助性T 細胞17（Th17）、調節性T 細胞（Treg）互相拮抗維持機體免疫狀態相對穩定，Th17/Treg 失衡被證實可參與AR發生［2］。微小RNA（miRNA）是多種疾病發病的調控因子，參與哮喘、AR 發病過程［3］。let-7e是由22個核苷酸組成的內源性非編碼miRNA，通過靶向細胞因子信號抑制因子4（SOCS4）抑制AR 小鼠白細胞介素-13 刺激介導的鼻上皮細胞炎癥因子表達，在AR病情進展中發揮保護作用［4］。金晶晶等［5］研究發現，miR-155-5p 參與免疫、炎癥反應及細胞分化發育，在Treg/Th17 平衡調控中扮演重要角色。let-7e、miR-155-5p 是否參與 AR Treg/Th17 平衡調控尚不清楚。本研究檢測AR 患者血清let-7e、miR-155-5p 表達，分析二者與Treg/Th17 平衡的關系，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 1 月—2019 年 6 月我院耳鼻喉科收治的98例AR患者。納入標準：①典型陣發性噴嚏、流鼻涕、鼻癢、鼻塞，符合2015 年天津AR診治指南相關標準［6］；②年齡18周歲以上；③知情同意并簽署同意書。排除標準：①血管運動性鼻炎、非變應性鼻炎伴嗜酸粒細胞增多綜合征、感染性鼻炎、激素性鼻炎、藥物性鼻炎等其他鼻部疾病；②近1 個月未服用抗組胺、糖皮質激素藥物；③近期罹患急慢性感染性疾病。其中，男50 例、女48 例，年齡23～56（34.41 ± 4.72）歲；IgE 陽性 68 例，陰性 30例；變應原種類：季節性AR（花粉、真菌）57 例，常年性AR（塵螨、蟑螂、動物毛發等）41 例；癥狀發作時間：間歇性AR（癥狀發作＜4 天/周或＜連續4 周）53例，持續性AR（癥狀發作≥4 天/周或≥連續4 周）45例；疾病嚴重程度：輕度AR（癥狀輕微，對生活影響小）37 例，中重度AR（癥狀重，嚴重影響生活質量）41 例；伴支氣管哮喘39 例。另選擇60 例健康志愿者為對照組，健康志愿者均為我院門診體檢健康者。男 32 例、女 28 例，年齡 21～52（35.95 ± 4.61）歲。兩組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。本研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 血清let-7e、miR-155-5p表達和Treg/Th17及其相關細胞因子檢測 AR 患者入院后24 h（健康志愿者體檢當日）采集肘靜脈血3 mL，注入EDTA 抗凝管混勻，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm），取上層血清于EP 管置于-80 ℃超低溫冰箱保存。RT-PCR 法檢測 let-7e、miR-155-5p 表達：TRIzol 法提取總RNA，采用M-MLV 逆轉錄酶（Epicentre 公司）按照試劑盒說明將其轉錄為cDNA。CFX96 實時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad）檢測血清中miR-155-5p、let-7e表達，引物合成及序列測定由上海基康生物技術有限公司完成，引物序列：let-7e 正向引物5'-TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT-3'，反 向 引 物 5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；miR-155-5p正向引物5'-CCGCGCTTAATGCTAATTG-3'，反向引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。反應條件：95 ℃變性 10 s，65 ℃退火 20 s，75 ℃延伸 15 s，共40 個循環。以 U6 snRNA 為內參，2-ΔΔCt法計算 miR-155-5p相對表達量，共做3 次平行試驗，取平均值。ΔΔCtmiR-155-5p =ΔCtmiR-155-5p -ΔCtU6 snRNA，ΔΔCtlet-7e=ΔCtlet-7e-ΔCtU6 snRNA。

EPICS-XL 流式細胞儀檢測 Th17、Treg 細胞占比，計算Th17/Treg。酶聯免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-6（IL-6）、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10、轉化生長因子-β1（TGF-β1）水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩對比采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關分析變量之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清 let-7e、miR-155-5p 表達和 Treg、Th17及其相關細胞因子比較 AR組與對照組血清let-7e相對表達量分別為0.72±0.21、1.35±0.46，miR-155-5p相對表達量分別為1.81±0.35、1.15±0.26，AR組let-7e表達、Treg細胞、Treg/Th17、IL-10、TGF-β1低于對照組（P均＜0.05），miR-155-5p表達、Th17細胞、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23高于對照組（P均＜0.05），見表1。

表1 兩組外周血Treg細胞、Th17細胞及其相關細胞因子水平比較（）

表1 兩組外周血Treg細胞、Th17細胞及其相關細胞因子水平比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別AR 組對照組TGF-β1（ng/L）50.34±6.43*89.34±12.34 n 98 60 Treg細胞（%）2.31±0.35*4.86±0.79 Th17細胞（%）1.35±0.37*0.52±0.17 Treg/Th17 1.71±0.30*9.35±0.51 IL-6（ng/L）6.12±1.24*3.26±0.75 IL-10（ng/L）50.21±6.35*89.35±10.47 IL-17（ng/L）16.35±2.95*5.39±0.94 IL-22（ng/L）19.35±5.26*8.56±3.26 IL-23（ng/L）35.15±9.35*21.35±6.57

2.2 不同臨床參數AR 患者血清let-7e、miR-155-5p 表達比較 中重度者血清let-7e 表達低于輕度者（P＜0.05），miR-155-5p 表達高于輕度者（P＜0.05）。IgE 陽性者血清let-7e 表達低于陰性者（P＜0.05），miR-155-5p 表達高于陰性者（P＜0.05）。伴哮喘者血清let-7e 表達低于無哮喘者（P＜0.05），miR-155-5p 表達高于無哮喘者（P＜0.05）。不同年齡、性別、變應原、癥狀發作時間let-7e、miR-155-5p 表達無統計學差異（P均＞0.05），見表2。

表2 不同臨床參數AR患者血清let-7e、miR-155-5p表達差異

2.3 血清 let-7e、miR-155-5p 表達與 Treg/Th17 的相關性 血清let-7e 表達與Treg、Treg/Th17 呈正相關（r分別為 0.406、0.467，P均＜0.05），與Th17 表達呈負相關（r=-0.512，P＜0.05）。miR-155-5p 表達與Treg、Treg/Th17 呈負相關（r分別為-0.495、-0.468，P均＜0.05），與 Th17 表達呈正相關（r=0.598，P＜0.05）。

2.4 血清let-7e、miR-155-5p表達與Treg、Th17相關細胞因子相關性 血清let-7e 表達與IL-10、TGF-β1水平呈正相關（r分別為0.435、0.467，P均＜0.05），與 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平呈負相關（r分別為-0.419、-0.464、-0.406、-0.312，P均＜0.05）。miR-155-5p 表達與 IL-10、TGF-β1水平呈負相關（r分別為-0.457、-0.368，P均＜0.05），與 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平呈正相關（r分別為 0.437、0.538、0.495、0.398，P均＜0.05）。

2.5 血清let-7e、miR-155-5p 表達的相關性 血清let-7e 表達與miR-155-5p 表達呈負相關（r=-0.594，P＜0.05）。

3 討論

AR是臨床最常見的非傳染性鼻炎，以鼻黏膜慢性炎癥為主要特征。近年來隨著環境改變，就醫條件提高，AR 檢出率逐漸上升。據報道，我國AR 的發病率為4%～38%［6］。AR 的發病機制復雜，肥大細胞、嗜酸性粒細胞、Th2 型細胞、炎癥介質等均參與其中，Th17、Treg 細胞具有共同的前體細胞即CD4+T 細胞，由TGF 分化下形成，被認為是Th1/Th2的分支。Th17 細胞引起自身免疫和炎癥反應，Treg細胞則抑制免疫和炎癥反應、維持免疫穩態。生理情況下，Th17/Treg 處于動態平衡，保持免疫穩定。Th17/Treg 失衡可能導致機體炎癥反應、自身免疫疾病的發生［7］，AR 患者 Th17 細胞增加，Treg 細胞減少，Th17/Treg 處于失衡狀態［3］。Th17、Treg 細胞分化和平衡調節通過細胞內轉錄、信號途徑實現，miRNA在免疫細胞發育分化中起調控作用，其異常表達可能導致免疫紊亂［3］。

let-7e 是 miR-let-7 家族 miRNA，參與胚胎發育、干細胞分化、炎癥反應、腫瘤發生、神經系統疾病產生等多種生理和病理過程［8］，在炎癥反應中let-7e被抑制，增加促炎細胞因子表達，加劇炎癥反應［9］。動物實驗顯示，let-7e 過表達可抑制炎癥因子、組胺、IgE 和 TNF-α 水平，在 AR 中發揮抗炎作用［3］。let-7e在AR、哮喘患者鼻腔黏膜中表達下調［10］。本研究發現，AR 患者血清 let-7e 表達明顯降低。LI 等［3］研究結果顯示，let-7e 通過激活JAK1/STAT3 通路靶向抑制SOCS4 表達，改善AR 癥狀和病情進展。提示let-7e 缺失可能引起SOCS4 過表達，導致免疫缺陷和炎癥反應，促使AR 發生和進展。let-7e 是否通過Treg/Th17 參與AR 發病機制尚不清楚。有研究顯示，let-7e 可促進 Th17 細胞發育，let-7e 通過靶向TLR4調節巨噬細胞內毒素耐受性［11］。本研究發現，與對照組比較，AR 組 Treg 細胞、Treg/Th17 均降低，Th17 細胞增高，AR 患者 Treg/Th17 系統處于失衡狀態，let-7e 表達與 Treg、Treg/Th17 呈正相關，與 Th17表達呈負相關，說明let-7e 表達缺失可能導致Th17過表達，Treg表達受抑制，介導和加劇炎癥反應。研究顯示，給予let-7e 激動劑可改善AR 小鼠鼻黏膜結構，抑制炎性細胞浸潤，降低Th17 細胞亞群占比、IgE、IL-17A 水平，提高 Treg 細胞亞群占比、IL-10 水平［12］，let-7e表達有助于維持Treg/Th17細胞平衡，減輕炎癥反應。let-7e可能通過調控Treg/Th17系統參與AR發病機制。

miR-155-5p 是 miR-155 家族成員，來源于 B 細胞整合簇，B 細胞整合簇功能通過miR-155 二級結構實現，miR-155 在人胸腺、脾臟、肺等富含免疫細胞器官中高度表達，在Th細胞分化、細胞因子生成、免疫監管中發揮重要作用［13］。有研究顯示，miR-155在免疫性血小板減少癥患者中表達上調，且與B淋巴細胞功能相關［14］，miR-155在過敏性紫癜患者表達升高，參與調節過敏性氣道炎2 型固有淋巴細胞、IL-33信號傳導［15］。本研究觀察了 miR-155-5p 在 AR 患者外周血中也出現表達上調，與 SUOJALEHTO 等［10］報道結果一致。相關性分析結果顯示，miR-155-5p 與Treg、Treg/Th17呈負相關，與Th17表達呈正相關，說明miR-155-5p 過表達與Treg/Th17 免疫失衡有關。臨床報道顯示，miR-155 過表達與過敏性紫癜患兒Treg/Th17 細胞失衡有關，miR-155 與 Th17 細胞占比及其特異性轉錄因子RORγt 呈正相關，與Treg 細胞及其轉錄因子 Foxp3 呈正相關［16］。研究顯示，miR-155-5p 過表達可加重AR 小鼠鼻炎癥狀，促進IgE、Th17 相關細胞因子表達，抑制Treg 相關細胞因子表達［17］。miR-155-5p調控Treg/Th17平衡的機制尚未完全闡明，miR-155通過抑制靶基因Jumonji富含AT 結合結構域 2，促進 Th17 細胞功能［18］，miR-155 通過SOCS1 負向調控IL-2 受體信號通路，調控Treg 細胞分化［19］。

IL-10 是let-7e 的功能靶點，可抑制炎性細胞激活、遷移和黏附，起到抗炎作用［20］。TGF-β1可抑制免疫細胞增殖、淋巴細胞分化、炎性細胞因子產生，并能誘導 Treg 細胞產生，TGF-β1、Treg 細胞在 AR 患者均降低，TGF-β1/Treg 參與 AR 發病［21］。IL-6 可促使 CD4+T 細胞向 Th17 細胞分化，IL-17、IL-22、IL-23是Th17 細胞相關因子，具有介導T 細胞炎癥反應作用，在 Th17 反應為主的 RA 患者中 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平明顯升高。本研究相關分析結果顯示，let-7e 與 IL-10、TGF-β1呈正相關，miR-155-5p 與之呈負相關，let-7e 與 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 呈負相關，miR-155-5p 與之呈正相關，miR-155-5p 與 let-7e 呈負 相關 ，說 明 miR-155-5p、let-7e 在 RA 患者Treg/Th17 平衡調節中發揮相互調節、相互抑制作用，miR-155-5p 過表達，let-7e 表達缺失可誘導 Th17相關細胞因子釋放，抑制Treg 相關細胞因子合成，進而增加炎癥反應。

本研究發現，miR-155-5p、let-7e 表達均與 AR 疾病嚴重程度、IgE 表達、是否伴哮喘有關，說明miR-155-5p、let-7e表達水平可反映AR 病情，為病情評估提供一定參考。IgE 介導的Ⅰ型變態反應是AR 發病的核心機制，IgE 水平越高，AR 發作強度越大［22］，因此IgE 陽性病例Treg/Th17 平衡破壞更嚴重。AR與哮喘屬于“同一氣道、同一疾病”，伴哮喘的AR 患者局部氣道、全身炎性反應更重，Treg/Th17 失衡更明顯。

綜上所述，AR 患者血清let-7e 表達下調，miR-155-5p 表達上調，let-7e 表達缺失，miR-155-5p 過表達介導的Treg/Th17 失衡可能參與AR 發病和病情進展。let-7e、miR-155-5p在AR Treg/Th17失衡機制中可能發揮相互調節、抑制作用。