葛根素對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及對鉑類敏感性的影響

胡亞麗，范玉宏，楊杰，龐茜茜

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北張家口075000

肝癌是中國常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均較高，且呈逐年增高趨勢。手術(shù)為臨床治療肝癌的主要方式，但由于肝癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯過了手術(shù)時機，且肝癌術(shù)后易轉(zhuǎn)移，患者5 年復(fù)發(fā)率高達60%。針對晚期肝癌患者，臨床多采用放、化療等、但腫瘤細(xì)胞耐藥性嚴(yán)重影響了效果［1］。因此，尋找一種新的抗腫瘤藥物十分必要。葛根素是從豆科植物野葛中提取而來的一種具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗凋亡等藥理學(xué)作用的異黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能在宮頸癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤作用，其可通過改善機體的免疫功能、提高化療敏感性、抑制細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡等發(fā)揮作用［2］。目前關(guān)于葛根素對肝癌治療效果的研究報道較少。因此，本研究針對葛根素對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及對鉑類耐藥性的影響進行探討?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2 細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。葛根素購自湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司（批號20081205），注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字號：國藥準(zhǔn)字H37021357，20200713），DMEM 高糖培養(yǎng)基（No. 296469）、胰蛋白酶（25200-056）、胎牛血清（10099-141）購自美國Gibco 公司，激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）單克隆抗體（兔單抗，AC033）、B 細(xì)胞淋巴 瘤/白 血 病 -2（Bcl-2）單 克 隆 抗 體（小 鼠 ，AW986256）、BCL2-Associated X 的蛋白質(zhì)（Bax）單克隆抗體（鼠/人，AJ1079a）、β-actin 抗體（21338）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（貨號40302ES20），聚偏二氟乙烯膜（PVDF）購自Millipore 公司（ISEQ00010）；Floustar 多功能微板分析儀購自德國BMG 公司，DYY-11 型多用電泳儀購自北京六一儀器廠，流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Electron 公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的HepG2 細(xì)胞，常規(guī)解凍復(fù)蘇后將其接種于DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度70%～80%時，采用0.25%胰蛋白酶消化，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL。將HepG2 細(xì)胞分為空白對照組、葛根素三個劑量組（10 μg/mL 組、20 μg/mL 組和 40 μg/mL 組）、順 鉑 40 μg/mL 組 、葛 根 素20μg/mL+順鉑20μg/mL（聯(lián)合組），每組設(shè)10 個復(fù)孔；將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將葛根素針無菌劑溶于無菌蒸餾水中配制成濃度為80μg/mL 的葛根素母液，并用無菌蒸餾水稀釋為10、20、40μg/mL的稀釋液，在層流倉的超凈臺中取無菌順鉑溶于無菌蒸餾水中，配制為濃度40μg/mL 的順鉑母液，并稀釋為40、20μg/mL溶液。于每孔中加入不同實驗濃度藥物300μL，使最終藥物濃度為葛根素組分別為10、20、40 μg/mL，順 鉑 40 μg/mL，葛 根 素20μg/mL+順鉑20μg/mL?？瞻讓φ战M不做任何藥物干預(yù)，僅給予培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取材并進行各指標(biāo)測定。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT 法。取處理48 h 后的各組細(xì)胞（空白對照組、葛根素三個劑量組、順鉑40 μg/mL 組、聯(lián)合組），經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于 96 孔板，每組 10 個復(fù)孔，隨后置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔滴加5 mg/mL MTT 溶液各 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，滴加二甲基亞砜150μL，避光振蕩孵育10 min。采用多功能微板分析儀測定490 nm 波長處的吸光度（A）值，根據(jù)A 值計算細(xì)胞的增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（實驗組A 值-空白組A 值）/（對照組A值-空白組A值）］×100%。

1.4 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況檢測 取處理48 h后的各組細(xì)胞（空白對照組、葛根素三個劑量組、順鉑40μg/mL 組、聯(lián)合組），采用0.25%胰蛋白酶消化后，0.01 mol/L PBS 溶液洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，隨后依次加入PI 和Annexin V 溶液，室溫避光反應(yīng)20 min，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布情況，并分析細(xì)胞凋亡狀況，計算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表達測定 采用Western blotting 法。取處理48 h 后的各組細(xì)胞（空白對照組、葛根素三個劑量組、順鉑40 μg/mL組、聯(lián)合組），采用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA 蛋白定量法對總蛋白濃度進行檢測。取35μg總蛋白，行10%SDS-PAGE恒壓電泳分離蛋白，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 上，TBST漂洗3 次后，采用5%脫脂奶粉封閉120 min，加入熒光一抗（1∶600），4 ℃孵育過夜，隨后加入熒光二抗（1∶4 000），室溫孵育2 h；經(jīng)TBST 漂洗3 次后，通過雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描PVDF 膜，進行半定量分析，通過灰度值計算蛋白濃度，將β-actin 內(nèi)參濃度作為已知且單一條帶的蛋白樣品，通過待測樣品盒內(nèi)參樣品灰度值做對比計算待測樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布用表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 各組HepG2 細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。進一步兩兩比較，聯(lián)合組增殖抑制率最高，其次為葛根素40 μg/mL 組；葛根素 40 μg/mL 組凋亡率最高，其次為聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 不同組別HepG2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較（%，）

表1 不同組別HepG2細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較（%，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與順鉑40 μg/mL 組比較，bP＜0.05；與葛根素10μg/mL組比較，cP＜0.05；與葛根素20μg/mL組比較，dP＜0.05；與葛根素40 μg/mL組比較，eP＜0.05。

凋亡率3.56±1.53 36.56±5.79a 18.99±4.61ab 43.12±7.48abc 68.10±9.94abcd 57.99±8.22abcde 147.96＜0.05組別空白對照組順鉑40μg/mL組葛根素10μg/mL組葛根素20μg/mL組葛根素40μg/mL組聯(lián)合組F P增殖抑制率0 38.51±5.74a 22.31±4.15ab 39.95±6.21ac 62.83±8.95abcd 65.04±9.11abcd 160.76＜0.05

2.2 葛根素對人肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響 各組G0/G1期、S期和G2/M期所占比例比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；進一步兩兩比較，順鉑40μg/mL組、葛根素20 μg/mL 組、葛根素40 μg/mL 組和聯(lián)合組G0/G1期所占比例均高于空白對照組；空白對照組S期所占比例最高，其次為葛根素10μg/mL組；空白對照組G2/M 期所占比例最高，其次為葛根素10 μg/mL 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；聯(lián)合組G0/G1期所占比例最高，S期和G2/M期所占比例最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 不同組別HepG2細(xì)胞的各細(xì)胞周期所占比例比較（%，）

表2 不同組別HepG2細(xì)胞的各細(xì)胞周期所占比例比較（%，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與順鉑40 μg/mL 組比較，bP＜0.05；與聯(lián)合組比較，cP＜0.05。

G2/M期19.22±0.80c 12.19±0.89ac 16.48±0.77abc 7.13±0.52abc 5.97±0.46ab 5.88±0.48a 163.41＜0.05組別空白對照組順鉑40μg/mL組葛根素10μg/mL組葛根素20μg/mL組葛根素40μg/mL組聯(lián)合組F P G0/G1期38.13±1.23c 58.08±2.96ac 42.80±2.39abc 53.83±2.74abc 65.43±3.25ab 66.47±2.40a 182.45＜0.05 S期42.65±1.61c 29.72±2.24ac 40.72±2.10abc 39.04±1.62abc 28.60±1.40a 27.65±1.44a 170.36＜0.05

2.3 葛根素對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的 影 響 各 組 Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2 和 激 活 型Caspase-3蛋白表達比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；進一步兩兩比較，其余5 組的Bax、Bax/Bcl-2和激活型Caspase-3 蛋白表達均高于空白對照組，空白對照組Bcl-2 蛋白表達水平最高，其次為葛根素10 μg/mL 組；葛根素 40 μg/mL 組Bax/Bcl-2 蛋白表達最高，其次為聯(lián)合組；葛根素40 μg/mL 組激活型Caspase-3蛋白表達最高，其次為聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表3。

表3 各組Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白相對表達量比較（）

表3 各組Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白相對表達量比較（）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與順鉑40 μg/mL組比較，bP＜0.05；與聯(lián)合組比較，cP＜0.05。

組別空白對照組順鉑40μg/mL組葛根素10μg/mL組葛根素20μg/mL組葛根素40μg/mL組聯(lián)合組F P激活型Caspase-3 0.11±0.27c 0.18±0.06ac 0.22±0.07ac 0.34±0.13abc 0.50±0.16abc 0.45±0.09ab 30.41＜0.01 Bax 0.16±0.04c 0.30±0.17ac 0.24±0.07ac 0.43±0.11abc 0.75±0.15abc 0.64±0.20ab 37.69＜0.01 Bcl-2 0.65±0.16c 0.32±0.08a 0.46±0.11abc 0.42±0.07abc 0.28±0.06a 0.29±0.07a 33.15＜0.01 Bax/Bcl-2 0.33±0.12c 0.84±0.34ac 0.58±0.14abc 1.13±0.24abc 2.71±0.70ab 2.36±0.45ab 45.66＜0.01

3 討論

肝癌是全球致死率較高的惡性腫瘤之一，手術(shù)和化療為肝癌患者的主要治療方式，但該方式僅能控制原發(fā)腫瘤，當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、化療耐藥等情況時則會影響治療效果及預(yù)后，甚至引起嚴(yán)重不良事件［3］。對于肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥機制進行研究，從而找到肝癌治療的新方法，降低患者病死率是目前迫切需要解決的難題。從中草藥中提取天然成分作為一種發(fā)現(xiàn)新藥的方法，已越來越被人們所接受和應(yīng)用。葛根素是一種異黃酮類化合物，1993 年衛(wèi)生部批準(zhǔn)臨床使用，最初主要用于治療腦血管疾病，經(jīng)過進一步研究，發(fā)現(xiàn)葛根素對癌癥有一定療效。研究表明，葛根素在提高胃癌、膀胱癌等化療敏感性，逆轉(zhuǎn)化療耐藥方面具有積極作用［4-5］。本研究探討了葛根素對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對鉑類敏感性的影響，結(jié)果顯示，葛根素三個劑量組對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制率均高于空白對照組，且隨著葛根素濃度的增加，HepG2 細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增高。表明葛根素可以抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，且其作用呈濃度依賴性。以順鉑為基礎(chǔ)的化療方案為臨床常用的肝癌治療方式，本研究結(jié)果顯示，葛根素聯(lián)合順鉑組增殖抑制率高于順鉑40μg/mL組，表明葛根素能夠提高人肝癌HepG2細(xì)胞對順鉑的敏感性。LI 等［6］研究了葛根素6"-O-木糖苷在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC-7721 和HepG2 中的作用，結(jié)果表明葛根素可以降低肝癌細(xì)胞活力、增殖，促進肝癌細(xì)胞的自噬和線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果與之一致。

Bcl-2、Bax 為 Bcl-2 家族基因成員，為調(diào)控細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，但兩者發(fā)揮相反的作用，其中Bcl-2 為促癌基因，其可以與凋亡刺激因子結(jié)合，從而抑制Caspase-3 的活化，降低游離鈣水平，并通過抑制線粒體的破裂，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用［7-10］；其能保護細(xì)胞免受各種原因的死亡，提高細(xì)胞存活率，從而增加細(xì)胞數(shù)量。在某些腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)Bcl-2基因表達上調(diào)時，腫瘤細(xì)胞不會死亡，或延長其存活時間，表明Bcl-2 基因與腫瘤密切相關(guān)。而Bax 為抑癌基因，其能間接促進細(xì)胞色素C 的生成及Caspase-9 蛋白活化，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用［11］。而且，Bax 與 Bcl-2 還可以相互作用，兩者可以結(jié)合為同源或異源二聚體，從而相互抑制。因此，Bax/Bcl-2 在一定程度也可以反映Bcl-2 家族基因在細(xì)胞凋亡過程中的作用。本研究結(jié)果顯示，葛根素不同劑量組、葛根素+順鉑組、順鉑組的Bax、Bax/Bcl-2 和激活型Caspase-3 蛋白表達均高于空白對照組，葛根素10 μg/mL 組的Bcl-2 蛋白表達除空白組外最高；葛根素 40 μg/mL 組 Bax/Bcl-2 和激活型Caspase-3 蛋白表達最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Caspase 為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，可以參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡途徑。正常情況下，Caspase與其抑制劑結(jié)合，以無活性的蛋白酶原形式存在，而在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下，Caspase 將被激活，大量水解細(xì)胞中的靶物質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。Caspase-3 在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，其既可以激活細(xì)胞凋亡過程，又可以參與整個細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控，因此Caspase-3可以作為細(xì)胞凋亡的常用監(jiān)測指標(biāo)。表明Bax、Bcl-2 和激活型Caspase-3蛋白可能是葛根素促進人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的重要機制之一。研究表明，葛根素可以通過調(diào)節(jié)不同機制導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)在和外在Survivin和 XIAP、PI3K/AKT/mTOR、Ras-Raf-MEK-ERK、JNK、細(xì)胞周期、AMPK、NF-κB、炎癥和自噬途徑［13］。本研究表明，葛根素可通過調(diào)控Bax、Bcl-2和激活型Caspase-3 蛋白促進人肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡。ZHANG 等［14］研究探討了葛根素對蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)保護作用的機制，結(jié)果表明這種保護作用可能由 Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3 和 SIRT3/SOD2凋亡信號通路介導(dǎo)的，證實葛根素對于Bcl-2/Bax通路的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，葛根素能抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進肝癌細(xì)胞凋亡，提高人肝癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的作用，其可能與葛根素能夠抑制細(xì)胞的有絲分裂、改變細(xì)胞周期及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達等有關(guān)。