LncRNA DANCR 表達(dá)與NSCLC 患者鉑類藥物化療敏感性及預(yù)后的關(guān)系

王超，賈瑞，李健

秦皇島市第一醫(yī)院胸外科，河北秦皇島066000

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是一種起源于支氣管黏膜或肺組織的最常見肺癌類型，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均位居首位［1］。NSCLC早期癥狀不明顯，多數(shù)確診時(shí)已進(jìn)展至Ⅲ～Ⅳ期?；熓峭砥贜SCLC的主要治療手段，但存在耐藥性差異，患者預(yù)后差別較大，而基因表達(dá)差異可能是導(dǎo)致腫瘤耐藥的關(guān)鍵因素。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種亞類非編碼RNA，其長度超過200nt，呈明顯的組織特異性及細(xì)胞特異性，具有維持基因穩(wěn)定性、調(diào)控細(xì)胞增殖及改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)的作用［2-3］。分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA（DANCR）主要位于染色體4q12，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在胃癌、乳腺癌中呈高表達(dá)，與癌細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥性密切相關(guān)［4］。研究表明，在乳腺癌組織中，LncRNA DANCR 能靶向結(jié)合miR-216A-5P，從而激活胚胎轉(zhuǎn)錄因子八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）和性別決定區(qū)Y 框蛋白2（SOX2），使癌細(xì)胞增殖速度加快［4］。既往研究表明，LncRNA DANCR能參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程［5］。目前，LncRNA DANCR 對NSCLC 的預(yù)后及化療敏感性報(bào)道罕見。因此，本研究旨在探索NSCLC 組織LncRNA DANCR表達(dá)與鉑類藥物化療敏感性及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2016 年1 月—2017 年11月收治的126例NSCLC患者，其中男68例、女58例，年齡（58.67 ± 9.14）歲；腺癌50 例、鱗癌61 例、其他類型癌 15 例；中分化 34 例、低分化 92 例；Ⅲ B 期 43例、Ⅳ期83 例；吸煙66 例、不吸煙60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）關(guān)于NSCLC的臨床實(shí)踐指南2009版》［6］中關(guān)于ⅢB～Ⅳ期診斷標(biāo)準(zhǔn)，且由病理檢查證實(shí)（經(jīng)皮穿刺或支氣管鏡取活檢）；②NSCLC患者自愿配合整個(gè)化療過程，并按時(shí)回院接受隨訪復(fù)查，且基本資料完整；③既往無放化療史和肺部手術(shù)史；④能耐受化療過程且對化療藥物不過敏者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺結(jié)核、重度慢性阻塞性肺疾病及嚴(yán)重支氣管擴(kuò)張者；②合并胃癌、食管癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤者；③伴有免疫系統(tǒng)缺陷者；④肝、腎功能不良者。隨訪時(shí)間均為1～36個(gè)月，起始時(shí)間至截止時(shí)間為2016年1月—2020年11月，期間無失訪病例。NSCLC患者均于試驗(yàn)前簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（編號2020F036）。

1.2 治療方法 支持治療：為患者準(zhǔn)備合理的飲食搭配；患者入院化療期間對其進(jìn)行心理健康輔導(dǎo)，增強(qiáng)治療信心；盡量減少抗生素及糖皮質(zhì)激素的使用?；煼桨福?］：采用常規(guī)鉑類藥物聯(lián)合新型化療藥物（多西他賽聯(lián)合順鉑）化療。其中多西他賽（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；規(guī)格：20 mg/支）劑量為75 mg/m2，于第1 天靜脈滴入1 h，而順鉑（齊魯制藥有限公司；規(guī)格：10 mg/支）劑量為75 mg/m2，于第1 天經(jīng)5%葡萄糖溶液稀釋后靜脈滴入。21 d為1個(gè)周期，共治療2個(gè)周期。NSCLC患者均行肺部CT 掃描，依據(jù)RECIST1.1 實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)［7］評估2 個(gè)周期的化療情況。完全緩解（CR）：原病灶完全消失，且未出現(xiàn)新發(fā)病灶，腫瘤標(biāo)志物維持正常水平超過4 周。部分緩解（PR）：原病灶最大徑之和較前減小≥30%，且至少4 周未見增大。病情穩(wěn)定（SD）：原病灶最大徑之和較前減?。?0%或增大＜20%。病情進(jìn)展（PD）：原病灶最大徑之和較前增大≥20%，或病灶數(shù)量較前增多?；熋舾?CR+PR，化療不敏感=SD+PD。

1.3 LncRNA DANCR 表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。癌組織經(jīng)皮穿刺或支氣管鏡取NSCLC組織及正常肺組織（癌旁5 cm 處），經(jīng)液氮速凍后統(tǒng)一置于-80 ℃冰箱。樣本均采集30 mg，于冰上均勻研磨，向其中滴加1 mL TRIzol 試劑（Invitrogen 公司；批號20151223）提取總RNA。通過反轉(zhuǎn)錄Prime-ScriptTMRT Master Kit 試劑盒（Fermentas 公司；批號20151229）合成cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqTM［寶生物工程（大連）有限公司；批號20151230］檢測LncRNA DANCR表達(dá)。LncRNA DANCR反應(yīng)條件均為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR 擴(kuò)增體系：SYBR Green 10μL、sense primer 1μL、antisense primer 1μL、ddH2O 6μL及cDNA 2μL，共計(jì)20μL。LncRNA DANCR正向引物序列為5'-CGTCTCTTACGTCTGCGGAA-3'、反向引物序列為5'-TGGCTTGTGCCTGTAGTTGT-3'，內(nèi)參基因GAPDH 正向引物序列為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'、反向引物序列為5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。 LncRNA DANCR 的PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min、變性95 ℃ 5 s、退火55 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1 min，共擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列由上?？党晒矩?fù)責(zé)合成。以相對Ct 值法檢測LncRNA DANCR 的表達(dá)量，以ΔCt 值為結(jié)果，相對于 GAPDH 的比值為 2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 生存分析不同LncRNA DANCR 表達(dá)患者的生存差異，生存率比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。通過Cox回歸模型分析患者預(yù)后影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 及癌旁正常組織中LncRNA DANCR 的表達(dá)比較 NSCLC 及癌旁正常組織中LncRNA DANCR 的相對表達(dá)量分別為 3.65 ± 1.41、1.52 ±0.67，二者比較，P＜0.01。

2.2 NSCLC 組織中LncRNA DANCR 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 LncRNA DANCR 表達(dá)與組織分化程度和 TNM 分期有關(guān)（P均＜0.05），而與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤病理類型無關(guān)（P均＞0.05），見表1。

表1 NSCLC組織中LncRNA DANCR 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（）

表1 NSCLC組織中LncRNA DANCR 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（）

臨床病理特征年齡（歲） 0.186 ＞0.05≥60＜60吸煙n LncRNA DANCR t/F P 70 56 3.67±1.19 3.63±1.21 0.217＞0.05是 否66 60 3.63±1.02 3.67±1.05組織分化程度 4.626 ＜0.05中分化低分化性別 0.105 ＞0.05 34 92 2.85±1.06 3.95±1.47男 女68 58 3.66±1.02 3.64±1.11病理類型 0.076 ＞0.05腺癌鱗癌其他類型癌TNM分期 4.927 ＜0.05ⅢB期Ⅳ期50 61 15 3.61±1.03 3.67±0.91 3.70±0.96 43 83 2.91±0.83 4.03±1.72

2.3 不同化療效果患者癌組織中LncRNA DANCR表達(dá)比較 患者均經(jīng)2 個(gè)周期的化療，化療敏感者50 例，LncRNA DANCR 癌組織中相對表達(dá)量為2.93 ± 1.01，化療不敏感者 76 例，LncRNA DANCR相對表達(dá)量為4.12±1.67，二者比較，P＜0.01。

2.4 NSCLC 癌組織中LncRNA DANCR 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以NSCLC 癌組織中LncRNA DANCR表達(dá)量的中位數(shù)3.66 為臨界值，其中高表達(dá)者65例，低表達(dá)者61 例，高表達(dá)者、低表達(dá)者的3 年總生存率分別為 12.31%（8/65）、29.50%（18/61），LncRNA DANCR 高表達(dá)者的3年總生存率較低表達(dá)者低（χ2=6.150，P=0.013）。

2.5 NSCLC 患者預(yù)后影響因素的Cox 回歸模型分析 Cox 回歸分析顯示，TNM Ⅳ期、低分化、鉑類藥物耐藥及LncRNA DANCR 高表達(dá)是影響NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見表2。

表2 NSCLC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸模型分析

3 討論

循證醫(yī)學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國每年肺癌新增病例約70 萬例、死亡病例約60 萬例，新增病例中以NSCLC最常見，占 80%～85%［1］。NSCLC 是多種因素協(xié)同并經(jīng)歷多個(gè)步驟所致，與空氣污染、易感基因、職業(yè)性質(zhì)及吸煙密切相關(guān)［1］。對于晚期NSCLC，因患者基本上已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，放化療是控制其進(jìn)展、延緩患者生存時(shí)間的主要手段。目前，以鉑類化療為基礎(chǔ)聯(lián)合其他新型化療藥物（多西他賽、吉他西濱、阿法替尼及培美曲塞等）是臨床常用的化療方案，其療效與患者的耐藥性密切相關(guān)［6］。近年來，基因組學(xué)和分子生物學(xué)已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，DNA 甲基化、LncRNA 及組蛋白修飾等過程對腫瘤的起病和進(jìn)展至關(guān)重要。它們能阻遏或誘導(dǎo)原癌基因的表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，從而影響腫瘤演變的進(jìn)程及對化療藥物的敏感程度［8-9］。

LncRNA 是一種不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，不具有完整的開放閱讀框，通過競爭性抑制內(nèi)源競爭性RNA、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、修飾基因甲基化等方式調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化、增殖等過程［9］。LncRNA DANCR 于2012 年首次被發(fā)現(xiàn)，由915 個(gè)堿基組成，具有3 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，對細(xì)胞的終末期分化具有明顯的抑制作用［10］。同時(shí)，在軟骨的損傷修復(fù)、牙髓細(xì)胞分化及成骨分化中有重要的調(diào)控作用［10］。研究表明，在前列腺癌組織中，LncRNA DANCR 靶向調(diào)控多梳抑制復(fù)合物2（PRC2），使侵襲關(guān)鍵基因TIMP2/3 的啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄過程受阻，從而促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移［10］。GUO 等［11］發(fā)現(xiàn)，LncRNA DANCR 具有miRNA 海綿的作用，通過吸附miR-27a-3p 激活Rho 的卷曲螺旋激酶 1（ROCK1）/沉默 LIM 激酶 1（LIMK1）/絲切蛋白1（COFILIN1）信號通路，從而加速肝癌進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中LncRNA DANCR 高表達(dá)，提示 LncRNA DANCR 可能參與NSCLC 的癌變過程。其原因可能為NSCLC 組織中的抑癌基因異常，使LncRNA DANCR 的啟動(dòng)子無法甲基化，導(dǎo)致啟動(dòng)子活性增加，提高LncRNA DANCR 轉(zhuǎn)錄速度，使 LncRNA DANCR 表達(dá)上調(diào)［12］。本研究結(jié)果表明，LncRNA DANCR 表達(dá)與組織分化程度和TNM 分期有關(guān)，提示LncRNA DANCR 在NSCLC 的演化過程發(fā)揮重要調(diào)控作用。其原因可能為LncRNA DANCR 過表達(dá)誘導(dǎo)核受體視黃酸X受體α（RXRA）發(fā)生磷酸化，促進(jìn)磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）轉(zhuǎn)錄，同時(shí)激活磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/絲蘇氨酸激酶（AKT）信號通路，縮短其細(xì)胞周期，促進(jìn)癌細(xì)胞迅速分裂、分化［13］。此外，上調(diào)的LncRNA DANCR 能促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)EMT 過程，使癌細(xì)胞易于穿透細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)其侵襲和遷移能力［4］。

鉑類藥物的抗腫瘤機(jī)制主要通過結(jié)合癌細(xì)胞的核內(nèi)DNA，使其DNA 損傷，減緩癌細(xì)胞的增殖速度和侵襲程度［14］。鉑類藥物在NSCLC 化療初期癥狀顯著，但隨著化療周期的持續(xù)，其效果逐漸下降，其中癌細(xì)胞的多藥耐藥性是影響化療效果的主要因素，但其作用機(jī)制復(fù)雜，包含多種基因、信號通路，目前尚不清楚［14］。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中［15］，將攜帶 LncRNA DANCR 干擾序列的病毒載體注射至裸鼠體內(nèi)后，其內(nèi)癌細(xì)胞生長速度明顯減慢，同時(shí)，對細(xì)胞毒性藥物的敏感性增加。本研究結(jié)果表明，化療不敏感患者LncRNA DANCR 表達(dá)均高于化療敏感者，提示LncRNA DANCR 過表達(dá)時(shí)，癌細(xì)胞對化療的敏感度減低。其具體機(jī)制目前尚不清楚，可能與癌細(xì)胞啟動(dòng) EMT 使自身惡性程度增加有關(guān)［4，12］。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的LncRNA DANCR 能誘導(dǎo)細(xì)胞去分化或使細(xì)胞發(fā)生“干性獲得”，從而使腫瘤起始細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而腫瘤起始細(xì)胞能通過不斷修復(fù)損傷的DNA 而對鉑類化療藥物產(chǎn)生抵抗作用，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞對化療的敏感度減低［15］。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示，當(dāng)LncRNA DANCR 表達(dá)上調(diào)時(shí)，患者的預(yù)后時(shí)間更短，提示LncRNA DANCR 表達(dá)確實(shí)與NSCLC 患者預(yù)后生存周期有關(guān)。同時(shí)，Cox 回歸分析進(jìn)一步指出LncRNA DANCR 與NSCLC 患者預(yù)后有關(guān)，提示LncRNA DANCR 是預(yù)測患者預(yù)后生存時(shí)間的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，NSCLC 組織中 LncRNA DANCR 呈高表達(dá)，且與組織分化程度和TNM 分期有關(guān)，有助于預(yù)后評估，對化療敏感性有一定影響。