miR-27a-3p 在氧糖缺失-復(fù)氧復(fù)糖損傷PC12 細(xì)胞中的表達(dá)及其對PC12細(xì)胞增殖、凋亡的影響

李俊杰，彭麗佳，羅靖，熊莉，邵建林

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，昆明650000

缺血性腦卒中是目前常見和多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，有較高的致殘、致死率［1］。腦缺血發(fā)生后最有效的治療是通過溶栓或取栓，盡快恢復(fù)阻塞部位血管的再通，然而，腦血管再通、血流再灌注會引起某些部位缺血性腦組織的損傷或神經(jīng)功能的進(jìn)一步惡化，即發(fā)生腦缺血-再灌注損傷（CI-RI）［2］。CI-RI的機制較復(fù)雜，主要包括氧化應(yīng)激、興奮性毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載等，而細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是再灌注損傷早期引起缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因之一［3］。miRNAs是一種短鏈非編碼的小RNA，在各器官、組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在CI-RI 過程中，miRNAs是神經(jīng)元存活的重要調(diào)節(jié)因子［4-5］。近年研究表明，miR-27a-3p在黑色素瘤［6］、卵巢癌［7］、骨關(guān)節(jié)炎［8］等疾病中有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡作用。然而，有關(guān)miR-27a-3p在CI-RI中的相關(guān)研究鮮見報道。本研究擬應(yīng)用氧糖缺失-復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）損傷的PC12細(xì)胞模型，體外模擬CI-RI病理狀態(tài)，觀察miR-27a-3p在OGD/R損傷的PC12細(xì)胞中表達(dá)，探討miR-27a-3p對OGD/R損傷PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細(xì)胞細(xì)胞株購自中國科學(xué)院昆明動物研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；miR-27a-3p模擬物序列、miR-27a-3p模擬物陰性對照序列、miR-27a-3p 抑制劑序列和miR-27a-3p 抑制劑陰性對照序列由廣州復(fù)能基因有限公司合成；Ploybrene 慢病毒購自上海吉凱基因科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；MicroRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；miR-27a-3p、Caspase-3、Bax、Bcl-2、U6 和β-actin 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成；兔抗鼠Cleaved-Caspase-3抗體購自美國CST公司；兔抗鼠Bax、β-actin抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠Bcl-2 抗體購自美國GeneTex 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體購自美國Sigma公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek 公司；CFX96 實時熒光定量PCR儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 PC12 細(xì)胞用含10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基，以104/孔的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板后培養(yǎng)3 d，每2 d 換液1 次，培養(yǎng)箱環(huán)境為95%空氣+ 5% CO2，溫度37 ℃。待細(xì)胞融合度為80%時利用Ploybrene 慢病毒，參照說明書對細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，將miR-27a-3p 模擬物（Mimic）、模擬物陰性對照、抑制劑（Inhibitor）和抑制劑陰性對照轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 PC12 細(xì)胞 OGD/R 模型的制備 將 PC12 細(xì)胞用無糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱（95%N2+5%CO2）中培養(yǎng)（即氧糖缺失）2 h，之后將培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱（95%空氣+5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)（即復(fù)糖復(fù)氧），制備OGD/R模型。

1.4 細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8 實驗法。采用隨機數(shù)字表法將PC12細(xì)胞分為6組，每組取6孔：正常對照組（Ctrl 組）、氧糖缺失-復(fù)氧復(fù)糖組（OGD/R組）、miR-27a-3p 模擬物組（Mimics 組）、miR-27a-3p模擬物陰性對照組（Ctrl-M 組）、miR-27a-3p 抑制劑組（Inhibitor 組）和miR-27a-3p 抑制劑陰性對照組（Ctrl-I 組）。Ctrl 組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)；OGD/R 組分別于復(fù)氧復(fù)糖后 24 、48 、72 和 96 h 制備 OGD/R 模型；Mimics 組、Ctrl-M 組、Inhibitor 組和 Ctrl-I 組分別用加有Ploybrea 慢病毒感染細(xì)胞24 h 后進(jìn)行miR-27a-3p的過表達(dá)、過表達(dá)陰性對照、抑制表達(dá)和抑制表達(dá)陰性對照后，再分別于復(fù)氧復(fù)糖后24、48、72 和96 h 制備OGD/R 模型。然后將各組細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種到96孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，每孔加入預(yù)制的CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測量不同時間點各組細(xì)胞450 nm處的光密度值。

1.5 OGD/R 后不同時點miR-27a-3p 表達(dá)和各組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測 采用RT-qPCR 法。采用隨機數(shù)字表法將細(xì)胞分為Normal組、3 h組、6 h組和9 h 組，每組取6 孔。Normal 組細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)，3 h組、6 h組和9 h組進(jìn)行2 h的氧糖缺失后分別復(fù)氧復(fù)糖3、6 和9 h 制備OGD/R 模型。分別測定各組相應(yīng)時點miR-27a-3p 表達(dá)，并選擇表達(dá)差異最大的時點作為后續(xù)研究的時點，并按照1.4 的分組和處理分別測定各組miR-27a-3p 和促凋亡基因Caspase-3、Bax 及抗凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 相對表達(dá)量。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。 取 1 μg RNA 按 照 MicroRNAs 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑盒、mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），采用Sybrgreen 法，在CFX96 實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴增和檢測。mRNA 逆轉(zhuǎn)錄體系：20 μL（Mix 1 μL，Buffer 4 μL，樣品10 μL，ddH2O 5 μL）；條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。miRNA逆轉(zhuǎn)錄體系：20 μL（Mix 1 μL，polyA 1 μL，Buffer 5 μL，樣品 10 μL，ddH2O 8 μL）。條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。引物序列：miR-27a-3p：正向引物：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'，反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；Caspase-3 正 向 引 物 ：5'-TGAAAGACAAGCCCAAGGTTA-3'，反向引物：5'-TGGTGTTGAAGAGCAGAAAGC-3'；Bax 正 向 引 物 ：5'-CCCGAGAGGTCTTTTTCCG-3'，反向引物：5'-GCCTTGAGCACCAGTTTGC-3'；Bcl-2 正向引物：5'-GAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，反向引物：5'-GGGCTGGGAGGAGAAGATG-3'；U6 正向引物：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3'；β-actin 正向引物：5'-TGGCATCCACGAAACTACCTT-3'，反向引物：5'-AGACAGCACTGTGTTGGCGTA-3'。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 15 s 共循環(huán) 40 次，采集記錄熒光。最后得到 S 形動力曲線，讀取 Ct 值，用 2-ΔΔCt方法，與U6、β-actin 進(jìn)行校正后計算出基因的相對表達(dá)量。

1.6 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。按照1.4 的分組，各組細(xì)胞中加入適量RIPA 裂解液，于冰上充分裂解后取上清，用BCA 法測定蛋白濃度。在SDS-PAGE 凝膠系統(tǒng)中電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后，用5% 的脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗 Cleaved-Caspase-3（濃度 1∶1 000）、Bax（濃度1∶1 000）、Bcl-2（濃度 1∶1 000），4 ℃過夜。TBST 洗膜后，加入二抗（濃度1∶5 000），室溫孵育2 h，ECL 顯影。于凝膠成像儀采集圖像信息，用Image J 軟件測得各蛋白的灰度值，與相應(yīng)的β-actin 灰度值相比后分析得出各蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以表示，不同組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-27a-3p在PC12細(xì)胞中OGD/R后不同時間點的表達(dá) Normal 組、3 h 組、6 h 組和 9 h 組 miR-27a-3p 的相對表達(dá)量分別為 1.006 ± 0.140、0.449 ±0.025、0.306 ± 0.028、0.492 ± 0.027，與 Normal 組相比，miR-27a-3p的相對表達(dá)量在3 h組、6 h組和9 h組均降低（P均＜0.05），組間比較，6 h 組相對表達(dá)量最低（P＜0.05）。后續(xù)凋亡實驗中選擇OGD/R后6 h時點進(jìn)行研究。

2.2 miR-27a-3p 對 OGD/R 損 傷 PC12 細(xì) 胞 增 殖 活性的影響 與Ctrl 組相比，復(fù)氧復(fù)糖后48、72 和96 h，OGD/R 組細(xì)胞的增殖活性均降低（P均＜0.05）；與 Mimics-Ctrl 組相比，24、48、72 和 96 h，Mimics 組細(xì)胞增殖活性均升高（P均＜0.05）；與 Inhibitor-Ctrl組相比，72和96 h時Inhibitor組細(xì)胞增殖活性均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組PC12細(xì)胞增殖活性比較（）

表1 各組PC12細(xì)胞增殖活性比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組OD值96 h 1.804±0.044 1.552±0.046 *2.065±0.095 #1.544±0.158 1.378±0.103 &1.553±0.060 24 h 0.414±0.014 0.369±0.011 0.513±0.012 #0.360±0.012 0.347±0.017 0.352±0.009 48 h 0.784±0.072 0.591±0.017 *0.751±0.047 #0.615±0.032 0.480±0.027 0.555±0.045 72 h 1.394±0.017 1.246±0.133 *1.627±0.011 #1.337±0.068 1.006±0.146 &1.299±0.252

2.3 miR-27a-3p對OGD/R損傷PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響 與Ctrl組相比，OGD/R組miR-27a-3p 表達(dá)降低（P＜0.05），促凋亡因子 Caspase-3、Bax的mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05）、抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)量降低（P＜0.05）；與Mimics-Ctrl組相比，Mimics 組 miR-27a-3p 表達(dá)升高（P＜0.05），Caspase-3、Bax 的mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均降低（P均＜0.05），Bcl-2 表達(dá)升高（P＜0.05）；與Inhibitor-Ctrl 組相比，Inhibitor 組 miR-27a-3p 表達(dá)降低（P＜0.05），Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均升高（P均＜0.05），Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.05）。見表2、表3。

表2 各組細(xì)胞miR-27a-3p和凋亡相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量比較（）

表2 各組細(xì)胞miR-27a-3p和凋亡相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組Bcl-2 1.006±0.057 0.429±0.042 *1.547±0.066 #0.468±0.114 0.144±0.005 &0.359±0.060 miR-27a-3p 1.020±0.241 0.269±0.003 *1.100±0.334 #0.296±0.047 0.070±0.011 &0.228±0.022 Caspase-3 1.023±0.110 2.506±0.238 *0.558±0.073 #2.541±0.141 5.729±0.235 &2.570±0.177 Bax 1.032±0.101 3.093±0.681 *0.282±0.070 #2.558±0.188 6.230±0.510 &3.008±0.084

表3 各組細(xì)胞miR-27a-3p和凋亡相關(guān)因子蛋白相對表達(dá)量比較（）

表3 各組細(xì)胞miR-27a-3p和凋亡相關(guān)因子蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組Bcl-2 0.879 0±0.011 6 0.689 9±0.009 7 *1.229 0±0.007 4 #0.663 8±0.009 5 0.087 7±0.010 5 &0.289 7±0.010 0 Cleaved-Caspase-3 0.456 8±0.003 1 0.878 6±0.001 1 *0.010 0±0.000 0 #0.735 2±0.000 8 0.987 6±0.002 4 &0.558 3±0.000 3 Bax 0.489 2±0.002 3 1.327 3±0.000 3 *0.082 1±0.000 0 #1.295 5±0.000 5 2.287 4±0.008 6 &0.931 9±0.000 1

3 討論

CI-RI是缺血性腦卒中較嚴(yán)重的一種病理損傷過程，其發(fā)生率和病死率較高，臨床防治較難。miRNAs 是一類非編碼的小分子RNA，其通過綁定3′非翻譯區(qū)的靶標(biāo)，導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯受阻來調(diào)節(jié)編碼蛋白質(zhì)的基因表達(dá)，近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的各種病理過程，被認(rèn)為是各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的治療靶點之一［9］。miR-27a-3p 位于19 號染色體，被認(rèn)為是一種致癌基因，可促進(jìn)包括結(jié)直腸癌、胃癌和食管癌在內(nèi)的癌細(xì)胞惡性行為［10］。近年研究主要關(guān)注miR-27a-3p 在非腫瘤性疾病中的抗炎、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖等方面的作用。在兔骨關(guān)節(jié)炎體內(nèi)外模型研究中，ZHANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 miR-27a-3p 模擬物可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，同時降低炎性因子表達(dá)。JU 等［12］研究表明，miR-27a-3p 能抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷所致的細(xì)胞凋亡。

研究表明，大量miRNA 在腦缺血或再灌注損傷后表達(dá)發(fā)生改變，參與了缺血性腦卒中損傷與恢復(fù)過程的調(diào)控［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R 損傷后 miR-27a-3p表達(dá)降低，表明miR-27a-3p參與了OGD/R 損傷的病理過程。進(jìn)一步研究miR-27a-3p 對OGD/R損傷后細(xì)胞增殖的作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a-3p 后在復(fù)氧復(fù)糖 24、48、72 和 96 h 時細(xì)胞增殖活性均升高，而抑制 miR-27a-3p 表達(dá)后，在 72 和 96 h 細(xì)胞的增殖活性降低，證實miR-27a-3p 能促進(jìn)OGD/R損傷后 PC12 細(xì)胞的增殖。XU 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-27a-3p 在胃壁癌細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞增殖速度減慢，擴散和遷移能力下降。BAI 等［15］研究證實，miR-27a-3p 過表達(dá)促進(jìn)了大鼠股骨頭壞死模型成骨細(xì)胞的分化和增殖。此外，miR-27a-3p 下調(diào)增加了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）的單層通透性，抑制了 BMEC 增殖［16］。上述研究均表明 miR-27a-3p 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，我們的研究則在體外模型中證實了這一結(jié)論。

B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和促凋亡蛋白 Bax、Bak 等［17］。Caspase 家族亦是促進(jìn)凋亡的重要蛋白家族，是各種凋亡途徑的共同通路，而Caspase-3 是其主要成員之一，通過多種凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。本研究結(jié)果顯示，OGD/R損傷后促凋亡蛋白的表達(dá)均升高，抗凋亡蛋白表達(dá)降低；過表達(dá)miR-27a-3p 后促凋亡蛋白表達(dá)降低，而抗凋亡蛋白表達(dá)升高，抑制miR-27a-3p 表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了以上結(jié)果。表明在OGD/R 損傷的PC12細(xì)胞模型中，miR-27a-3p 具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。SUN等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)miR-27a-3p 表達(dá)能抑制Fas 相關(guān)蛋白與死亡域（FADD）的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞凋亡途徑的激活，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)血管重塑，對主動脈夾層具有保護(hù)作用。TANG 等［20］研究表明，過表達(dá) miR-27a-3p 降低了高糖誘導(dǎo)損傷的視網(wǎng)膜色素細(xì)胞的Caspase-3/9的活性和Bax 蛋白表達(dá)，抑制了細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)了該類細(xì)胞免受高糖損傷。XI 等［16］研究表明，在腦出血的動物模型中，miR-27a-3p 模擬物的治療抑制了血腫周圍神經(jīng)元的凋亡和水通道蛋白的上調(diào)，發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用。我們的研究則進(jìn)一步證實了miR-27a-3p 在CI-RI細(xì)胞模型中具有抑制凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，miR-27a-3p 在 OGD/R 損傷 PC12 細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-27a-3p 能促進(jìn)OGD/R 損傷PC12細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。