平菇培養料誘導處理初探*

李 娟，解文強，苑國民，周廷斌，彭學文

（唐山市農業科學研究院，河北 唐山 063000）

平菇（Pleurotus ostreatus）培養料類型主要有生料、發酵料、熟料3種[1-3]，3種類型各有優缺點。隨著近年來市場競爭加劇，錯季（高溫季節）出菇越來越多，由于氣溫較高，環境雜菌基數大，發酵料或生料栽培菌袋污染率較高，因此常采用熟料栽培。過去平菇栽培戶通常采用成本較低的燃煤鍋爐滅菌，但隨著環境污染治理力度的持續加強，這種方式在多個省份被禁用，對微利的平菇行業來說無疑是雪上加霜。誘導滅菌是將培養料中的真菌孢子、細菌芽孢等休眠體誘導萌發成營養體，然后再進行高溫滅殺的一種滅菌方法[4]。此方法既具有熟料滅菌的優勢，且滅菌成本低，是近年來行業內逐漸采用的培養料處理方法。但培養料在誘導過程中pH、溫度、微生物種群變化以及滅菌效果等方面尚缺乏基本數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

玉米芯、棉籽皮、麩皮、土豆、生石灰等均采購自市場；瓊脂購自石獅市環球瓊膠工業有限公司。

1.2 試驗配方

微生物培養、滅菌效果檢驗培養基為LB培養基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4；平菇培養料配方：玉米芯46.5%、棉籽殼46.5%、麩皮5%、生石灰2%，料水比 1∶1.4。

1.3 試驗儀器

pH計，杭州齊威儀器有限公司；DIJITAL S菌落計數儀，西班牙J.P.SELECTA公司；HH-420水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LCD-280S溫度計，常州市瑞明儀表廠；OSE-VX-01振蕩器，天根生化科技（北京）有限公司；移液器，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；誘導裝置為鋼筋混凝土澆筑，外覆保溫層，下置通風管道，外置離心空壓機、溫控儀等設備，可控制溫度。

1.4 誘導方法

原料按配方稱量、混合均勻后，置于誘導裝置內，每2小時通氣10 min，誘導40 h。

1.5 細菌、真菌計數方法

平皿計數法。于誘導裝置內隨機3點取樣，分別稱取原料樣品10 g于90 mL無菌水中，充分震蕩10 min，后吸取1 mL于9 mL無菌水中，充分震蕩5 min，稀釋至 10-9g·mL-1，選取 10-7g·mL-1、10-8g·mL-1、10-9g·mL-1（取樣時間不同，稀釋倍數略有調整）分別吸取0.1 mL涂布平皿，每個濃度3次重復，于26℃培養，統計菌落數。在誘導過程中每4小時取樣1次。

1.6 溫度、pH測定方法

將溫度計探頭預先埋入料堆內，上下兩層布置。下層探頭距料堆底部20 cm，上層探頭距離底部40 cm。在誘導過程中每2小時記錄1次。

pH測量，上述1.5取樣后，稱取樣品10 g加入50 mL蒸餾水中，充分震蕩30 min，過濾后使用pH計測量濾液，在誘導過程中每4小時測量1次。

1.7 滅菌方法

依上述1.5取樣涂布平皿后，將剩余各樣品置于95℃水浴鍋中5 min，冷卻后吸取0.1 mL涂布平皿，每濃度3次重復，于26℃培養，統計菌落數。

誘導結束后的培養料攤涼、裝袋，100℃滅菌2 h，冷卻至30℃以下時接種平菇菌種。滅菌結束后培養料亦取樣計菌落數，方法同1.5。

2 結果與分析

2.1 溫度和pH變化情況

不同取樣時間原料誘導后原料的溫度和pH變化見圖1。

圖1 溫度、pH變化曲線圖Fig.1 The transformation of temperature and pH

由圖1所示，拌料后4 h（第2次取樣），溫度快速上升3.5℃，pH隨之下降，下降幅度較小，僅下降了0.06。隨后的16 h，即至第6次取樣，溫度快速上升，累計升溫16.8℃，每小時上升1.05℃。這一時期也是pH快速下降的時期，由6.92下降至6.39，共下降了0.53，每小時下降0.03。由此直至誘導結束合計20 h內，溫度緩慢上升，總計上升3.9℃，每小時僅上升0.11℃，為第2階段的約1/10；pH先升后降，第9次取樣時pH明顯升高，8 h后達到整個誘導期的最低值6.07，直到誘導結束裝袋滅菌后再次測量，pH重新回升至6.48。

2.2 微生物數量變化情況

誘導過程中，微生物數量統計見表1。

表1 微生物數量記錄表Tab.1 The number of microorganisms

由表1可知，拌料開始至第3次取樣，耗時8 h左右，溫度顯著上升，從23.4℃上升到38.3℃，升溫9.9℃，pH下降0.19，細菌總數上升明顯，比拌料時增加了約5倍，達到3.900×1012個/g。滅菌后，細菌總數明顯下降，為2×108個/g。此時的細菌應為營養體和休眠體的混合物，休眠體可能包含尚未萌發的及萌發后再次生成。同一時期，真菌總數下降明顯，由最初的2.000×1012個/g減少為0.330×1012個/g，減少了約6倍。滅菌后總數維持在1×108個/g左右，休眠體萌發為營養體后被殺滅較多。

第4次至第7次取樣耗時14 h，此期間溫度為38℃～45℃，上升了6℃，pH持續下降，下降幅度0.22，達到整體誘導期的次最低值6.39，較初始pH下降了0.59。此間細菌總數急劇上升，滅菌前細菌總數未測出，滅菌后的細菌總數與滅菌前相差較少，說明大部分細菌為營養體。真菌總數繼續下降，直到第7次取樣不可測出。

第8次至第11次取樣耗時12 h，溫度持續上升，但上升速度減緩，只上升了2.2℃；pH則經歷了先上升后急速下降的過程，第9次快速上升至6.86（接近初始值），至誘導結束又快速下降至整個誘導期的最低值6.07。細菌總數則持續攀升，尤其滅菌后的細菌數量大量增加，最高達2.88×1010個/g。溫度的升高、pH的下降，導致細菌大量產生休眠體，在95℃處理5 min的條件下顯然不能達到滅菌效果。但真菌數量則持續下降，滅菌后未測出。

綜上試驗結果及真菌孢子、細菌芽孢的萌發條件可知，溫度在23℃～38℃，真菌孢子及細菌芽孢可大量萌發生長；隨著溫度的升高（達到45℃時），細菌仍能大量繁殖，真菌則不再生長；溫度持續升高，細菌產生芽孢，進入休眠狀態。無論是大量繁殖還是進入休眠狀態都不是理想狀態，所以誘導時溫度是關鍵因素。結合本文試驗結果，誘導溫度宜控制在23℃～38℃。

2.3 滅菌結果

按照 ISO7218∶2007（E）[5]或國標 GB 4789.3-2016菌落計數法計算[6]，樣品中均含有真菌或細菌，但總體數量均較低，統計結果見表2。

表2 100℃滅菌2 h不同稀釋倍數下菌落數統計Tab.2 Statistics of colony under different dilution times after sterilization by 100℃for 2 h

由表2可知，平菇培養料經過誘導后，真菌數量明顯下降，滅活后連續6批未能檢出；誘導過程中細菌數量大幅度增加，但經過100℃滅菌2 h后，僅有極微量的細菌存活。通過后續的接種、培養平菇菌種后，對平菇菌絲的生長無影響。

3 結論與討論

平菇培養料經過誘導處理后，pH經歷了下降、升高、下降的變化過程，溫度先期上升幅度較大，后期啟動誘導裝置制冷設備，阻止了溫度持續上升，上升幅度亦趨緩；真菌數量急劇下降（誘導至28 h時不可檢出），細菌總數持續大幅增加，最高達2.88×1010個/g。經過100℃滅菌2 h后，pH升高，細菌、真菌等殺滅效果較好，接種后對平菇菌絲的生長未有影響。

3.1 誘導時間

季節不同、外界溫度不同，誘導的起始溫度亦有差別。試驗中起始溫度為23.4℃，至誘導結束總計40 h。誘導20 h時，細菌數量急劇增加[7-8]，此時真菌總數卻大幅下降，甚至不可檢出，pH也明顯下降；此時期培養料狀態與誘導結束時的情況類似，誘導是否完全還有待于進一步試驗驗證。

3.2 pH變化

整個誘導期間pH出現了下降、升高、下降的變化過程，第1次下降是由于細菌的大量繁殖，產生了大量的酸類物質[9]，隨著時間的延長pH出現了上升的現象，可能是前期大量的酸類物質被利用。從平皿觀察，pH上升前后菌落形態統計未有顯著區別。誘導過程中所產生的酸類物質并未對平菇菌絲生長產生明顯的副作用，這與長期以來“拌料后盡快裝袋，避免產酸”觀點相悖，培養料發酵產酸導致pH下降對其菌絲生長沒有影響。

3.3 真菌變化

隨著誘導的進行真菌數量逐步減少，這與常路路[10]結論一致，但是究竟是減少（或失活）還是由于計數方法限制未能檢出還需要進一步試驗。誘導過程中細菌數量的急劇增加以及胞外分泌物的大量累積可能抑制了真菌孢子的萌發，或抑制了真菌菌絲片段的生長，導致在平板計數中未出現可見真菌菌落。此次試驗中放線菌未列為觀察對象，細菌種類也未進行詳細鑒別，后續試驗應引入高通量或從分子生物學水平加強試驗手段[11-14]，提高試驗結果可靠性、準確性。

由于平菇具有較廣泛的適應性，生產中采用的培養料眾多，除棉籽殼、玉米芯外，棉桿、蔗糖渣、豆秸、木屑等[15-18]均用于栽培平菇。采用誘導法處理培養料還需根據季節、原料（基礎微生物不同）通風（進風）溫度等的不同靈活掌握誘導時間。本次試驗中棉籽皮、玉米芯混合培養料，混合培養料初始溫度23℃，誘導40 h后，100℃滅菌2 h可用于平菇栽培。