口腔骨組織工程支架中的常用化學交聯劑及其應用進展

楊亞蘭，張震陽，謝元棟，李澤華，劉曉莉，李 毅

腫瘤、創傷、感染、牙周疾病等可引起頜面部骨組織缺損，植骨術作為常用的治療手段，存在骨供體有限、疾病傳播、免疫排斥、可能導致供體區并發癥等問題[1]。在這種背景之下，骨組織工程逐漸興起，它利用工程學和生命科學的原理開發骨替代物，為修復口腔骨缺損，重建其功能提供了一種新型手段。骨組織工程包括三個要素：支架、細胞和生長信號。支架通過模擬細胞外基質的微環境，為細胞生長、分化和骨組織形成提供結構支持。為了滿足骨組織工程的需要，理想的支架應具有生物降解性、機械穩定性、骨傳導性、骨誘導性及3D多孔結構等特征，而現有的純支架材料存在機械強度低、抗降解性差等問題，因此常采用交聯法對支架進行改性。

交聯誘導支架材料與交聯劑發生反應，形成氫鍵、離子鍵或者共價鍵，從而改善支架材料性能[2]。目前，交聯分為三種方式：物理交聯、化學交聯和酶交聯。由于物理交聯的效率較低、交聯鍵弱，酶交聯的費用高昂、具有底物特異性，而化學交聯能夠產生均勻而高效的交聯且成本適中[3]，因而化學交聯成為了目前的研究熱點。口腔骨組織工程中常用的化學交聯劑主要分為合成交聯劑和天然交聯劑。本文就一些常用化學交聯劑的特點、機制及應用作一綜述。

1 常用交聯劑的特點及交聯機制

1.1 合成交聯劑

1.1.1 戊二醛 戊二醛(glutaraldehyde，GTA)是一種同型雙功能交聯劑，它的兩個醛基能夠與蛋白質、多糖等聚合物的氨基或羥基發生反應[4]，形成穩定的共價鍵。

GTA具有成本低、反應效率高等優點，常采用蒸汽或溶液形式進行交聯[5]。GTA蒸汽多用于交聯多孔材料，避免了在材料中產生表面張力，無需反復冷凍干燥[6]，但它交聯材料費時，且會受材料厚度影響而導致交聯不良。GTA溶液交聯材料速度相對較快，且交聯效果好，但殘留的GTA難以完全清除。GTA的醛基能夠與細胞蛋白質、脂質、核酸發生反應導致細胞損傷甚至凋亡，引起宿主組織的炎癥和鈣化[7]，具有高細胞毒性，因而限制了其在材料改性中的應用。

目前，學者們針對GTA的細胞毒性，提出了一些降低其毒性的策略。如用蒸餾水、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline, PBS)反復沖洗，并用甘氨酸[7]、賴氨酸等氨基酸溶液或硼氫化鈉溶液中和支架上游離的醛基[8]。Casali等[9]發現用超臨界CO2對交聯的膠原膜處理僅1 h，即可去除超過95%的殘留GTA，且未影響膠原膜原有的機械性能。盡管上述方法能夠在一定程度上降低GTA交聯支架的毒性，但仍無法解決GTA從支架中逐漸釋放所帶來的毒性影響。

EDC是一種“零長度”交聯劑，即在介導兩個分子交聯時，不會引入新的物質，在反應結束后，它本身不留在支架中，而是轉變成一種細胞毒性極低的尿素副產物，這種副產物與過量的EDC可以通過稀酸或水從支架上洗滌去除[11]。通常將N-羥基琥珀酰亞胺與EDC聯用以減少副反應，穩定中間產物[12]。

同樣，EDC也具有一定的局限性。首先，EDC在交聯過程中會消耗支架材料中細胞識別所需的氨基酸側鏈，影響細胞對支架的粘附[13]。針對這一缺點，Malcor等[14]將含有細胞結合位點的三螺旋肽結合到膠原膜支架上，增強細胞的粘附和擴散；Bax等[13]將EDC與紫外線輻射結合交聯膠原膜，減少EDC的用量，保留細胞識別位點，增強細胞對支架的粘附，同時紫外線誘導膠原的芳香族側鏈交聯，維持膠原膜的力學性能。其次，與GTA相比，EDC交聯支架的機械性能及抗降解性較差[5]。另外，EDC的交聯效率呈pH依賴性，在pH 4～6時交聯效率最佳，在堿性條件下交聯效率很低，而支架上的氨基基團在堿性條件下則反應活性更好，這可能會影響EDC對支架的改性效率[10]，后述的兩個問題仍有待進一步的研究。

1.2 天然交聯劑

1.2.1 京尼平 京尼平(genipin，GP)是一種從梔子果實中提取出來的梔子苷水解產物，其毒性比GTA低[15]。GP具有多個活性基團，如羥基和羧基，能夠自發地與蛋白質、殼聚糖等的伯胺基發生反應[16]。GP在交聯時會發出熒光，可通過監測熒光強度來追蹤交聯效率及支架降解情況[17]。

GP交聯效率與GTA相近，且細胞毒性較小，是一種有前景的交聯劑，但GP的細胞毒性具有劑量依賴性及種屬、細胞特異性，高濃度時可影響細胞活性，甚至導致細胞死亡[18]，低濃度時對部分細胞仍有明顯細胞毒性[19]。因此在應用時應將使用劑量、交聯效果與細胞毒性綜合考慮。另外，由于GP的產量低、價格昂貴，限制了其推廣，目前主要用于實驗研究，因此GP的提取步驟有待優化，提取產量有待提高。

1.2.2 檸檬酸 檸檬酸(citric acid，CA)是一種有機三羧酸，可以從植物中的檸檬、柑橘及動物的骨骼、牙齒等物質中提取出來。CA的三個羧基可與氨基和羥基反應，形成較為穩定的共價鍵，從而為多糖和蛋白質等提供交聯[20]。CA脫氫后產生的共軛堿基可以參與三羧酸循環[21]，并且支架降解釋放的CA片段可作為細胞的營養物質，因此CA具有良好的生物相容性。此外，CA基聚合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌作用，這歸因于CA基聚合物中檸檬酸鹽衍生的大量游離羧基能螯合細胞壁中的金屬離子，改變細胞壁的通透性，影響細菌對營養的吸收，從而導致細胞損傷然后死亡[22]。

1.3 其他交聯劑

1.3.1 環氧化合物 環氧化合物(epoxy compounds，ECs)是一種具有三元環醚結構的化合物，在酸或堿的催化下可與聚合物中的氨基、羥基、羧基等官能團產生開環反應[23]，發生三點交聯，生成具有三維網狀結構的大分子，故采用ECs交聯的支架材料機械性能表現優良。目前，ECs常用于心臟瓣膜、氣管、血管等部位支架的改性，經其處理的生物材料具有良好的生物相容性、柔韌性及親水性、較低的免疫原性、較強的抗鈣化能力[24]。ECs在交聯過程中可能會因為交聯不完全而殘留環氧基，后者具有一定的細胞毒性，但通過處理，環氧基易水解生成羥基，其細胞毒性降低[25]，能夠滿足醫用材料的安全要求。由此可見，采用ECs交聯的支架材料綜合性能優良。目前常用的ECs有乙二醇二縮水甘油醚(商用環氧樹脂)、聚乙二醇二縮水甘油醚等。

1.3.2 低聚原花青素 原花青素是一類可從多種植物(如花生皮、葡萄籽)中提取出來的多酚類化合物，由單體兒茶素通過碳—碳鍵聚合而成，其中聚合度小于10的聚合物稱為低聚原花青素(oligomericproanthocyanidins，OPCs)。OPCs含有多個酚羥基，多通過與其他聚合物之間形成非共價鍵(如氫鍵)發揮交聯作用。研究發現，OPCs能夠增強膠原蛋白網絡的交聯密度，從而增強牙本質彈性模量[26]。天然來源的OPCs對細胞的毒性很小，甚至能夠促進細胞增殖[27-28]。此外，OPCs有一定的抗炎作用。活性氧作為一種炎癥信號因子及炎性介質，在濃度較高時會導致傷口缺血性修復不良，而富含羥基的OPCs具有強大的抗氧化性，從而加速傷口愈合[29]。

2 在口腔骨組織工程支架改性中的應用

2.1 改善機械性能

骨組織工程支架對力學性能的要求較為復雜，需具有抗壓縮、抗拉伸、抗疲勞等特性，以承受負荷，維持缺損部位的空間結構，為組織新生提供結構支持。Yang等[5]比較了GP、GTA、EDC對明膠海綿支架交聯后壓縮彈性模量的影響，結果表明，三個交聯組的機械強度明顯提高，干燥狀態下均達到700 kPa以上，在濕潤狀態下，GP和GTA組的壓縮模量顯著高于EDC組。這提示著GP和GTA的交聯效率相當，能夠與明膠產生高度交聯，在濕潤狀態下溶脹程度較小，從而保持較高的機械強度。Babo等[30]制備了經GP交聯的血小板裂解物(platelet lysate，PL)支架。PL來源于血清，機械強度較差。PL經交聯后不會發生收縮，能持續穩定釋放生長因子，并表現出粘彈性，特別適用于諸如牙周膜等承受動態機械負荷的組織。

通常，支架機械強度的增加會伴隨著支架孔隙率的降低。支架孔隙的大小、形狀、數量、互通性等也會影響成骨效果，研究表明支架的孔徑大于100 μm、孔隙率高于80%更有利于細胞和組織長入支架[31]。Goudouri等[32]分別采用GP和EDC交聯，制備了孔隙彼此貫通、孔徑300～600 μm及孔隙度90%以上的復合支架，這種高度多孔隙結構有利于細胞的粘附增殖、植入區域的血運重建及營養物質和代謝廢物的轉運，最終成功促進牙槽骨再生。

2.2 增強抗降解性能

支架材料在較長時間內維持結構穩定性至關重要，通過交聯可以顯著減緩其降解速度，使支架在足夠長的時間內為細胞增殖、分化和骨再生提供結構支持。Yang等[5]在體外實驗中比較了分別采用GP、GTA、EDC交聯的明膠海綿支架的抗水解性，結果顯示，未交聯組在幾分鐘內完全溶解，而GTA和GP組1個月內幾乎無質量損失，5個月后仍保留原質量的94%，EDC組的質量1個月內下降到87.3%，5個月后損失近50%。Shalumon等[31]在PBS溶液中對比了分別采用EDC和GTA交聯明膠/羥基磷灰石凝膠支架的抗水解性，結果發現EDC交聯組的抗水解性與GTA交聯組相比較差，推測可能是由于EDC交聯產生的酰胺鍵親水性強，而GTA交聯產生的亞胺鍵有更高的水解穩定性。

由于支架在植入體內后還會受到多種酶的消化，因此，除抗水解性之外，支架還需要具有一定的抗酶解性。有學者將經GTA交聯的血清來源支架接種人脂肪間充質干細胞后植入大鼠下頜骨缺損處，90 d觀察到支架仍有部分保留，成功誘導缺損處的骨再生[33]。隨后Redondo等[34]在臨床研究中驗證了上述GTA交聯支架修復上頜骨囊性骨缺損的能力，并且沒有嚴重的不良反應產生。然而，有學者發現，支架材料延遲降解可能會引發炎癥反應而影響再生骨骼的質量[35]。Yang等[5]的體內實驗也證明了這一點，他們分別將經GTA、GP和EDC交聯的支架材料植入大鼠皮下后發現，交聯明顯延長了支架的降解時間，免疫排斥反應較重，材料周圍均有較厚的組織增生。因此，如何在通過交聯提高支架抗降解性的同時保證支架的生物相容性，仍是有待解決的問題。

2.3 潛在的成骨作用

骨主要由羥基磷灰石晶體鑲嵌于膠原纖維之間組成。有些交聯劑除發揮交聯作用外，還對新生骨形成起調節作用。研究發現CA是一種天然的磷酸鈣成核分子，在礦化過程中對誘導和穩定羥基磷灰石的生長起重要作用，從而參與調節骨礦化[36]。Raucci等[37]采用CA交聯制備可注射纖維素水凝膠，研究CA對成骨分化的影響。結果表明粘附于交聯水凝膠表面的細胞其堿性磷酸酶活性顯著提高，并且這些細胞表達骨相關標志物的基因上調。Chen等[38]將CA交聯支架放入模擬體液鹽溶液中，觀察到支架表面有礦化球狀晶體沉積，并且這些晶體的數量和大小隨時間延長而增加。Shalumon等[31]分別采用EDC和GTA交聯制備明膠/羥基磷灰石凝膠支架，體外實驗發現EDC交聯組細胞的堿性磷酸酶活性顯著高于GTA組，產生的鈣結節鈣磷含量最高，鈣磷比值最接近于理想比值(1.67)，成骨相關基因表達(堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅱ型膠原)均高于GTA組，這些表明相比GTA，EDC在促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化方面更有優勢。Kulakowski等[28]采用經OPCs處理的牙本質基質培養牙髓干細胞，發現細胞內參與牙本質形成和生物礦化的關鍵基因(骨鈣蛋白、骨形態發生蛋白-2等)上調。但CA、EDC、OPCs作為交聯劑在口腔骨組織工程領域的研究較少，其成骨作用仍有待進一步研究。

2.4 其他作用

交聯可以將一些具有促進骨再生、血管再生等作用的生物活性物質(如藥物、生長因子)添加至支架上，并調節這些活性物質的釋放速率，從而充分發揮其生物學作用。有研究表明，經交聯后控制釋放的生物活性物質，可以誘導更多的骨組織形成[39]。Das等[40]采用EDC將血管內皮生長因子和骨形態發生蛋白-6交聯至聚乳酸-乙交酯共聚物支架上，并使得兩者持續釋放達21 d，進一步將支架植入大鼠下頜骨的缺損部位，發現含有兩種生長因子的實驗組顯著增強了缺損部位的骨形成以及血管增殖。交聯還可將一些修飾蛋白接枝到支架材料上，對支架進行改性。Luo等[41]采用EDC將一種介導細胞粘附的整合素配體與缺乏細胞粘附配體的海藻酸鹽交聯，增強后者對細胞的親和力，促進細胞粘附增殖，提高細胞存活率。

此外，交聯可以修飾天然支架材料的抗原位點，降低其抗原性[42]。有研究發現，與未交聯支架相比，交聯支架上的骨髓間充質干細胞生長良好，細胞增殖和附著更多，并且更有利于細胞的成骨分化[43-44]。但也有學者發現支架經交聯后可能會引起異物反應，從而影響組織再生[45]。因此，交聯支架的生物相容性仍需更多的體內外實驗驗證。

3 總結及展望

骨組織工程要求支架具有足夠的機械強度及抗降解性，以支撐新骨形成，化學交聯劑可顯著增強支架材料的上述性能，但這些性能應與細胞生長、細胞外基質分泌及骨組織再生相匹配，因此應根據骨組織生長特性選擇合適的交聯劑及交聯條件，從而調節支架的降解速率。修復頜面骨缺損的支架其降解速率應控制在3～6個月。

此外，支架材料應具有良好的生物相容性，而當前用于支架材料改性的大多數交聯劑的一些非反應性殘基具有細胞毒性。目前來看，通過降低交聯劑的濃度或者封閉其毒性基團來降低其細胞毒性是較為有效的方式。我們仍然需要開發新的交聯方法及交聯劑，探索交聯參數，以制備機械性能、抗降解性和生物相容性俱佳的支架材料。