BMP1和mTLL1在牙齒發育中的研究進展

胡 菲，謝曉華

細胞外基質(extracellular matrix, ECM)是一個由蛋白質、多糖和水組成的復雜網絡，指導細胞命運并影響組織發育和穩態，其組成和結構的擾亂會破壞組織發育和穩態，并促進疾病的發生[1]。BMP1/TLD樣金屬蛋白酶(BMP1/tolloid-like proteinase family，BTP)屬于蝦紅素家族的成員，是細胞外基質金屬蛋白酶小家族[2-3]。在哺乳動物中有4種BTP，包括骨形態發生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP1)、哺乳動物 tolloid(mammalian tolloid，mTLD)、哺乳動物tolloid 樣 1(mTLL1)和哺乳動物tolloid 樣 2(mammalian tolloid-like 2，mTLL2)[4]。BTP通過加工一些細胞外基質蛋白對一些組織器官發育起調控作用。眾多研究表明，BMP1和mTLL1在牙齒發育中發揮重要作用。這兩個蛋白酶在切割和激活分泌到前期牙本質-牙本質復合體和牙周膜的ECM蛋白方面具有共同功能[5]。本文就BMP1和mTLL1的結構、功能及其在牙齒發育中的研究現狀作一介紹。

1 BMP1和mTLL1的結構及分布

1.1 BMP1和mTLL1的結構

BMP1最初是在能夠異位誘導成骨的骨提取物中鑒定的，然而，與在這些提取物中發現的其他骨形態發生蛋白不同的是，BMP1不是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員，而是一種鋅依賴性的金屬蛋白酶[6]。Bmp1位于8號染色體上(8p21.3)[7]。mTLD是由Bmp1編碼的更長剪接變體，此外，還有兩種在遺傳上不同的哺乳動物BTP：mTLL1和mTLL2，分別由Tll1和Tll2編碼[3]。Tll1位于4號染色體上(4q32.3)[8]。

BMP1和mTLL1具有相似的蛋白質結構域結構，其中BMP1蛋白酶結構包括氨基末端前結構域、ASTIN樣的金屬蛋白酶結構域以及羧基末端的3個“complement-uegf-BMP1”(CUB)結構域和一個表皮生長因子(epitheloid growth factor，EGF)樣的結構域，與BMP1不同的是，mTLL1具有5個CUB結構域和2個EGF結構域[3，9]。

1.2 BMP1和mTLL1的分布

BMP1和mTLL1在牙和骨骼等多種組織中共表達[10]。Bmp1在小鼠成牙本質細胞、牙周膜細胞和牙槽骨表面的成骨細胞中高表達，同時也在牙髓細胞中表達；在豬牙蕾的成牙本質細胞和前期牙本質中表達[5，11]。Tll1在小鼠成牙本質細胞、牙周膜細胞、牙槽骨表面的成骨細胞中表達，但表達水平低于Bmp1[5]。上述表明Bmp1在牙本質和牙周膜的形成中可能比Tll1發揮更重要的作用。在小鼠成牙本質細胞和牙周膜細胞、人的修復性牙本質和成牙本質細胞以及豬牙髓-前期牙本質-牙本質復合物中檢測到BMP1蛋白；在小鼠成牙本質細胞中檢測到mTLL1蛋白[5，11-12]。

2 BMP1和mTLL1的功能

BMP1和mTLL1由兩個不同的基因編碼，但同屬于一個結構相似、功能重疊的細胞外基質金屬蛋白酶小家族(BTP)[3]。體外研究表明，該蛋白酶家族的4個成員在切割和激活細胞外基質蛋白方面具有重疊活性[13-14]。

許多蛋白先以前體形式表達，然后經過蛋白酶的加工轉變成有生物活性的蛋白質[15]。BTP作為金屬蛋白酶參與此加工過程，主要作用是裂解并激活許多細胞外基質蛋白，在調節ECM形成中起重要作用[3]。這些蛋白包括膠原蛋白、富含亮氨酸的小蛋白聚糖、整合素小配體N-連接糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein，SIBLINGs)、賴氨酰氧化酶、脯氨酰氧化酶、基膜成分、潛在的TGF-β結合蛋白[4，6]。其中SIBLINGs在牙本質中表達，并具有調控牙本質形成的作用，其5個家系成員包括骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、基質細胞外磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoprotein，MEPE)、牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)和牙本質涎磷酸蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)[16]。另外據報道，BTP還能夠激活TGF-β1，從而促進ECM的合成[6]。

最新研究結果顯示Bmp1和Tll1敲除后，心血管組織中還存在尚未確定的代償機制[17]，BMP1和mTLL1通過使膠質球蛋白失活作為一種額外的調節機制來確保周圍神經系統(peripheral nervous system，PNS)朗飛結正確的時空組裝[18]。

3 BMP1和mTLL1在牙體組織發育中的作用

3.1 BMP1和mTLL1促進牙本質的形成和礦化

牙本質發育不全(dentinogenesis imperfecta，DGI)是一種常染色體顯性遺傳疾病，其特征是牙本質礦化不良和牙本質結構改變[19-20]。Syx等[21]報道的4個BMP1突變的患者中有2個表現出典型的DGI癥狀：半透明和脆弱的牙齒，伴有棕色和乳光色，支持BMP1在牙本質形成和礦化中起重要作用的觀點。

Wang等[22]通過他莫昔芬誘導組織中普遍存在的Cre表達使Bmp1和Tll1在小鼠出生后同時被敲除，結果顯示該小鼠牙本質變薄和礦化缺陷、前期牙本質層擴大、牙根變短以及牙齒萌出延遲，其中磨牙牙根礦化率的降低程度比牙冠更為嚴重。另外Zhang等[5]通過構建Col1a1-Cre;Bmp1flox/flox;Tll1flox/flox小鼠模型(dcKO小鼠)，使表達Ⅰ型膠原蛋白細胞中的Bmp1和Tll1均失活，導致dcKO小鼠下頜第一磨牙牙根變短、牙本質變薄、牙髓腔增大以及牙本質小管排列紊亂且數量少于正常小鼠。綜上所述，BMP1和mTLL1的活性對于牙本質(尤其是根部牙本質)的形成和礦化至關重要。

3.2 BMP1和mTLL1影響牙體組織發育的機制

牙本質細胞外基質由90%的Ⅰ型膠原和10%的非膠原蛋白組成，其中非膠原蛋白DMP1和DSPP在調控成牙本質細胞分化和牙本質基質形成礦化中起重要作用[23-24]。多項研究表明，BTP裂解并激活Ⅰ型膠原蛋白、DMP1和DSPP[4，13，25]。由此可見，BTP對于牙本質形成礦化的重要性。

為闡明BMP1和mTLL1在牙本質形成及礦化中的作用機制，Wang等[22]進一步研究。其組織學分析顯示，BMP1和mTLL1廣泛缺失小鼠的牙髓細胞增殖減少且成牙本質細胞分化減少以及極化缺失；分子機制研究表明，膠原蛋白在牙本質中蓄積，非膠原蛋白DMP1和DSPP急劇減少。Wang等[22]認為BMP1和mTLL1蛋白酶的缺失破壞了牙本質ECM正常形成礦化所需的膠原和非膠原蛋白水平的動態平衡，導致了膠原的異常堆積，并且積累的、經過異常加工的膠原蛋白可能會干擾非膠原蛋白DMP1和DSPP水平的穩態，從而出現了DGI樣表型。Zhang等[5]機制研究也顯示，dcKO小鼠牙本質中成牙本質細胞分化受到抑制，DMP1和DSPP的水平大大降低。此外，Dmp1-null[26]和Dspp-null小鼠都表現出相似的DGI樣表型，說明這兩種蛋白在牙本質形成礦化中起關鍵作用[27-28]。上述數據支持BMP1和mTLL1在控制牙本質的形成礦化及ECM膠原和非膠原蛋白穩態中起重要作用。

Zhang等[5]研究分析表明，與正常小鼠相比，Ⅰ型膠原蛋白表達細胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠前期牙本質層更寬，前期牙本質層中雙鏈多糖(biglycan)的總體水平明顯更高，磨牙牙本質中牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)減少。DSP是DSPP的N端片段，是前期牙本質-牙本質復合物中最豐富的非膠原蛋白[5]。以往研究表明，DSPP的蛋白水解過程對于形成健康的牙本質至關重要[29]。因此，推測dcKO小鼠的牙本質或前期牙本質中Ⅰ型膠原蛋白的切割失敗導致這些小鼠的牙齒缺陷，并且未能裂解DSPP也可能是造成dcKO小鼠牙本質缺陷的另一個主要因素[5]。Steiglitz等[13]研究發現在Bmp1/Tll1-null小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)培養中，DMP1的加工受到影響，這項研究表明BMP1和mTLL1在礦化組織形成中的進一步作用是通過DMP1的蛋白水解作用實現的。綜上所述BMP1和mTLL1通過水解加工DSPP和DMP1這兩種蛋白質，從而對牙本質形成及礦化起促進作用。

此外，一項關于豬牙本質的研究表明，包括BMP1在內的astacin蛋白酶裂解DSPP，并生成牙本質唾液蛋白-牙本質糖蛋白(dentin sialoprotein-dentin glycoprotein，DSP-DGP)復合物和牙本質磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)[11]。另外，Yamakoshi等[30]發現從DSPP嵌合體中釋放DPP的起始裂解位點周圍的氨基酸(在Gly472和Asp473之間)與BMP1的靶位點序列相匹配，并設計了含有Gly472-Asp473的熒光共振能量轉移(FRET)-DSPP肽，發現重組的人BMP1催化的FRET-DSPP肽正是在該DPP裂解位點裂解。Ritchie等[14]研究也證明了BMP1可以準確處理桿狀病毒表達的DSP-PP240，產生穩定的PP240和DSP430。由此可見，BMP1參與加工水解DSPP。Muromachi等[12]研究結果表明，BMP1的作用不僅限于作為催化酶加工牙本質特異性底物，還依賴于人類牙髓細胞中的細胞內在化作用來加速CCN2 / CTGF的產生從而參與骨樣修復性牙本質的形成，闡明了BMP1的一種新特性：增強骨樣修復性牙本質的形成。

4 BMP1和mTLL1在牙周組織發育中的作用

4.1 BMP1和mTLL1維持牙周穩態

有學者通過構建Bmp1和Tll1廣泛性敲除小鼠模型，結果顯示該小鼠牙周缺損進行性發展，表現為畸形的牙周膜(periodontal ligament，PDL)(不規則的PDL纖維)、牙槽骨量顯著減少、牙骨質減少并礦化不良(細胞牙骨質急劇減少，無細胞牙骨質附著功能出現病理變化)以及牙周破壞加速[31]。此外，Zhang等[5]構建了Ⅰ型膠原蛋白表達細胞中Bmp1和Tll1失活小鼠模型，結果顯示該小鼠牙槽骨缺失，PDL中的膠原纖維比對照組的小鼠厚，但并沒有發展成牙周袋。以上結果均表明，BMP1和mTLL1在維持牙周穩態中起重要作用。為了進一步探究BMP1和mTLL1在維持牙周穩態中的單獨作用，Wang等[32]將單Bmp1廣泛性敲除小鼠和單Tll1廣泛性敲除小鼠與雙敲除小鼠進行對比分析，單Bmp1廣泛性敲除小鼠與雙敲除小鼠均表現出嚴重的牙周缺損，其特征是PDL纖維丟失、擴大的PDL區域中異位骨化以及牙槽骨和牙骨質體積急劇減少，而單Tll1廣泛性敲除小鼠表現出非常輕微的表型，該結果表明在維持牙周穩態中BMP1比mTLL1發揮更重要的作用。

4.2 BMP1和mTLL1影響牙周組織發育的機制

為進一步研究其機制，Wang等[31]研究表明，BMP1和mTLL1廣泛缺失會導致PDL和牙槽骨中DMP1(成熟骨細胞的關鍵標志物)水平顯著降低，成骨細胞標志物骨唾液蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)的水平顯著增加，成骨細胞分化缺陷；基質金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP13)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)表達顯著增加，破骨細胞明顯增加，而骨細胞和牙骨質細胞減少；與ECM結構缺陷相關的前膠原Ⅰ(Ⅰ型膠原的前體分子)的生物合成過程降低，從而未切割的前膠原Ⅰ顯著增加；骨膜蛋白(PDL功能必需的基質蛋白)的水平變化與正常小鼠相似，表明該蛋白的缺陷不會導致異常PDL表型；最后，還證明了抗生素的全身應用顯著改善了牙槽骨和PDL損傷，因此顯示它們是病原體引起炎癥的部分繼發性疾病。以往研究也表明DMP1基因的缺失會導致PDL、牙槽骨和牙骨質缺損，從而增加對細菌感染的易感性[33]。以上發現表明BMP1和mTLL1通過提供成熟的膠原蛋白Ⅰ和有活性的DMP1來維持牙周基質的穩態；未切割的前膠原Ⅰ的積累、缺乏成熟的膠原蛋白Ⅰ以及活性DMP1的減少都會導致嚴重的牙周缺損，牙周缺損引起的炎癥可能導致更嚴重的牙周破壞[31]。同時，Wang等[32]研究發現單Bmp1 廣泛性敲除小鼠與Bmp1和Tll1雙敲除小鼠牙周組織中成熟的Ⅰ型膠原蛋白大大減少、未切割的前膠原Ⅰ積累以及BSP、OPN、TRAP陽性細胞水平增加，而單Tll1廣泛性敲除小鼠的變化相較更為溫和。因此，Wang等[32]認為BMP1，而不是mTLL1，在通過加工膠原蛋白前體來維持牙周穩態中起著主導作用。

Zhang等[5]研究表明Ⅰ型膠原蛋白表達細胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠PDL的膠原纖維比正常小鼠厚，這表明BMP1和mTLL1的雙重缺失可能改變了PDL的膠原結構。PDL中的主要膠原纖維是Ⅰ型膠原，并且以往研究表明BMP1和mTLL1充當前膠原Ⅰ的蛋白酶[4，34]。可推測dcKO小鼠中BMP1和mTLL1的缺失導致前膠原Ⅰ水解加工不良，而前膠原Ⅰ加工失敗可能是導致組裝異常、膠原纖維紊亂和增厚的主要因素之一[5]。 Syx等[21]透射電鏡分析也顯示，與BMP1基因突變相關的成骨不全癥患者的皮膚具有不規則的Ⅰ型膠原纖維，纖絲直徑可改變，并且某些纖絲比正常對照更厚。這與Ⅰ型膠原蛋白表達細胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠表現相似。

雖然Ⅰ型膠原蛋白是PDL的最主要成分，對組織至關重要，但眾所周知其他ECM分子，如骨膜蛋白和原纖蛋白-1等在健康PDL的形成和維持中也起著重要作用[35-36]。骨膜蛋白和原纖蛋白-1是PDL中的兩種ECM蛋白，其水平變化通常與PDL缺陷有關，Zhang等[5]研究表明，使小鼠Ⅰ型膠原蛋白表達細胞中Bmp1和Tll1失活，均可導致小鼠的PDL中原纖蛋白-1水平明顯降低，而骨膜蛋白的水平與正常小鼠相似。 由于原纖蛋白-1的失活與人類的牙周疾病有關[37]，Zhang等[5]認為原纖蛋白-1的水平降低可能是導致PDL結構異常的原因，但是目前對原纖蛋白-1的急劇減少與dcKO小鼠的PDL中BMP1 / tolloid樣蛋白酶的丟失之間的關系尚無明確的說法。

5 小 結

綜上所述，BMP1和mTLL1作為細胞外基質金屬蛋白酶，在切割和激活細胞外基質蛋白中發揮重要作用，促進成牙本質細胞和成骨細胞的分化，維持ECM中膠原和非膠原蛋白的穩態，在牙齒發育中發揮重要作用。但目前牙齒發育的分子機制尚不十分明確，仍有許多問題待解決，如其他ECM蛋白加工缺陷與牙齒發育異常的關系以及牙齒發育過程中復雜的信號交換等。未來在進一步研究的同時，也應將人類牙齒發育缺陷與動物模型相似的表型聯系起來，以便更好地了解這些疾病的病因，為臨床治療提供新思路。