感染期和休眠期結核分枝桿菌脂肪酸來源和利用差異的研究進展

周 穎，劉立英，秦守濤，叢 薇，李 東，孫江洋，時 坤，李健明，宗 穎，趙 丹，曾范利*，杜 銳*

(1.吉林農業大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.遼寧農業職業技術學院，遼寧 熊岳 115009；3.吉林市動物疫病預防控制中心，吉林 吉林 132001；4.吉林省永吉縣動物疫病預防控制中心，吉林 永吉 132100；5.吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；6.吉林省梅花鹿藥用資源利用關鍵技術研究室，吉林 長春 130118；7.吉林農業大學 農業質量標準與檢測技術研究中心，吉林 長春 130118)

結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的一種慢性的、危害嚴重的人畜共患病，不僅對人和動物的健康造成危害，還會引起巨大的經濟損失。2018 年，全球范圍內據估約有1 000萬(范圍為900萬～1 110萬)結核病新發病例，各國的結核病負擔差異較大，從每年每10萬人發病例數低于5例到超過500例，而全球平均約為130例[1]。盡管全球努力解決結核病的發病率和傳播問題，但每年仍約有1 000萬人被診斷患有此病，導致約200萬人死亡。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的國家之一。目前，結核病的治療方法主要是依據具體病情采取2種以上藥物的聯合用藥，短期在6～9個月，最終將活動性結核轉化成非活動性結核病，痰菌呈陰性，結核菌受到藥物控制進入休眠期[2]。結核分枝桿菌具有分枝桿菌屬的細胞壁脂質含量較高的特性。細胞內病原體的新陳代謝與它們的宿主細胞密切相關，特別是對于結核分枝桿菌，脂質恰好是這種相互作用的主要介質，這些化合物同時作為病原體的營養源和宿主免疫反應的調節劑。有研究發現，結核分枝桿菌的脂肪酸，是使其在宿主體內幸存下來的關鍵所在[3]。現就不同時期結核分枝桿菌脂肪酸合成利用差異的研究進展進行綜述。

脂肪酸(fatty acid)是指一端含有1個羧基的長的脂肪族碳氫鏈的有機物,是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。脂肪酸組成甘油磷脂的酰基鏈，甘油磷脂是細菌膜的主要和必不可少的組成部分[4-5]。細菌使用Ⅱ型脂肪酸合成系統合成脂肪酸，其中脂肪酸是使用離散的單功能酶從乙酰輔酶A前體通過2個碳原子的延伸來合成的[6]。脂肪酸在氧充足的情況下，可分解為CO2和H2O，釋放大量能量，因此脂肪酸是主要能量來源之一。結核分枝桿菌主要位于巨噬細胞吞噬體內以及發生肉芽腫病變的各種組織和區域的細胞外[7-8]，這些細胞和組織富含脂肪酸和膽固醇[8]。

1 感染期脂肪酸的合成和利用

1.1 感染期的結核分枝桿菌結核分枝桿菌進入宿主體內后，通過多種感染機制在宿主體內擴散，其中之一就是通過抗原遞呈細胞遞呈來感染巨噬細胞。在感染期間，結核分枝桿菌在巨噬細胞內大量復制，激活相關免疫應答反應，從而殺死結核分枝桿菌。但結核分枝桿菌內存在的一些毒力因子能夠有效抑制巨噬細胞凋亡，抑制巨噬細胞的免疫應答，巨噬細胞無法將結核分枝桿菌抗原提呈給T細胞，阻止效應T細胞的激活[9]，促進胞內結核菌的存活或持留[10]。

在感染期，結核分枝桿菌通過相關毒力因子促進巨噬細胞的凋亡，使結核菌更容易擴散和傳播，造成更嚴重的感染[11]，如通過肉芽腫的擴展和傳播來增強肉芽腫的形成；當細胞內結核分枝桿菌負荷達到閾值時，巨噬細胞發生凋亡，將結核菌遞呈給未感染的巨噬細胞，形成新的肉芽腫。結核分枝桿菌通過促進巨噬細胞死亡和被未感染的巨噬細胞吞噬[12]的途徑，在感染期初期間在宿主體內大量擴散，并形成有利于其的生存環境。

1.2 脂肪酸在感染期的來源結核分枝桿菌通過所處環境獲得脂肪酸，如通過水解宿主細胞膜脂質從宿主細胞獲得脂肪酸[13]。同時，結核分枝桿菌感染巨噬細胞，感染后形成的脂質體與吞噬小體迅速結合并融合，為細菌提供了豐富的脂質來源。穩定的脂肪酸合成來源，也為脂肪酸的利用提供基礎。

1.3 感染期脂肪酸的利用

1.3.1結核分枝桿菌利用脂肪酸供能 研究表明,結核分枝桿菌在感染期間主要使用脂肪酸而不是碳水化合物作為碳底物[3]。生長在小鼠肺中的結核分枝桿菌的呼吸受到脂肪酸的強烈刺激，但對碳水化合物沒有反應。多條證據表明，宿主脂質(脂肪酸和膽固醇)是感染期間結核分枝桿菌的關鍵碳源[14]。在20世紀50年代，確定在哺乳動物組織中繁殖的結核分枝桿菌優先代謝脂肪酸[15]，此后的大量研究反復證明，脂質代謝促進結核分枝桿菌在感染期間的存活[16-18]。

在感染期間，結核分枝桿菌可以通過水解宿主細胞膜脂質從宿主細胞獲得脂肪酸[13]，再通過β-氧化產生能量。乙醛酸循環作為結核分枝桿菌產生能量的重要途徑，結核分枝桿菌通過β-氧化，將脂肪酸降解為乙酰輔酶A單位，如果糖酵解底物不存在或稀少，則為不完整的乙醛酸循環。

1.3.2脂肪酸與結核菌毒力和細胞壁相關性 結核分枝桿菌利用脂肪酸產生所需代謝中間產物，其與結核菌的毒力相關。結核分枝桿菌利用脂肪酸產生毒力所需的重要生物合成前體、聚酮類脂(PDIM)、聚酰化海藻糖(PATs)、磺化脂類(SL)和真菌酸。脂肪酸合成酰基AMP引物，通過聚酮合成酶反復修飾酰基鏈以最終產生聚酮類脂，聚酰化海藻糖和磺化脂類[19]。研究表明，富含脂質的分枝桿菌細胞壁由海藻糖二醇酸組成，可誘導腫瘤壞死因子-α的反應，從而引起肉芽腫性炎癥反應[20]。誘導過量的腫瘤壞死因子-α反應是結核分枝桿菌毒力的另一種機制，有利于其在宿主中的存在而不被檢測到。同時，細胞膜最外層中PDIM的存在可保護結核分枝桿菌免受巨噬細胞產生的活性氮中間體的殺滅作用;另外，由于細胞膜最外層中的大量PDIM影響免疫活性成分的表面暴露，導致小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞分泌促炎細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α的下調[21]。

脂肪酸也是結核分枝桿菌細胞壁重要成分，并參與合成結核分枝桿菌細胞壁。結核分枝桿菌的細胞壁擁有高含量的分枝菌酸、脂類和多糖。分枝菌酸(mycolic acid,MA)是具有α-烷基-β-羥基的C60-90的長鏈脂肪酸，是分枝桿菌屬細胞壁主要的疏水性脂肪酸，占細胞壁干重的40%～60%[22]。MA在結核分枝桿菌的菌落形態、細胞壁的通透性、抗生素的敏感性、存活能力、致病性作用以及抵御宿主的免疫反應中扮演著重要的角色[23-26]。其中，酮-分枝菌酸和甲氧基分枝菌酸的有無可以明顯改變結核分枝桿菌細胞壁的通透性，若細胞壁的通透性降低，會導致結核分枝桿菌的壽命和毒力都降低。同時，C16-26脂肪酸通過專門的脂肪酸合成酶Ⅱ復合物(FASⅡ)產生霉菌酸[27]。霉菌酸即分枝菌酸是長鏈α-烷基-β-羥基脂肪酸，負責細胞壁的流動性以及其滲透性[28]，并在很大程度上被認為是結核分枝桿菌對脫水和化學處理的存在抵抗力的原因之一。

1.3.3結核菌利用脂肪酸產生磷脂和甘油三酯 結核分枝桿菌將脂肪酸同化到細胞膜磷脂中或轉化為甘油三酯。磷脂是維持細胞質膜完整性所必需的，結核分枝桿菌內的大多數短鏈不飽和脂肪酸位于磷脂中，而飽和脂肪酸作為霉菌酸的生物合成前體，或復雜脂質的取代基，被用于細胞包膜的外層。同時，當感染巨噬細胞并在其中生長繁殖時，結核分枝桿菌可以代謝整合脂肪酸和利用膽固醇，其中結核分枝桿菌利用脂肪酸來平衡膽固醇衍生的代謝中間體，使其加入細菌細胞壁脂質的生物合成[29]。脂肪酸轉化甘油三酯后則作為一種碳源能量儲存，當營養物質受到限制時可被分解供能[30]。同時，脂肪酸轉化為甘油三酯促進結核分枝桿菌的藥物耐受性[31]，這是一種結核分枝桿菌在體內感染期間通過免疫壓力進一步增強的表型耐受[32]。

2 休眠期的脂肪酸合成和利用

2.1 休眠期的結核分枝桿菌目前，結核病的治療藥物以化學藥物為主，主要是將活動性結核轉化成非活動性結核病，結核菌受到藥物控制進入休眠期，在休眠期內，結核菌不會復制，但可以保持活性并內化宿主脂質。但是，由于結核分枝桿菌為胞內寄生菌，可以長期在細胞內處于休眠狀態，直到宿主免疫系統被削弱，然后重新激活。結核病的病理原因復雜，很大程度上歸因于結核菌為建立初級感染而采取的免疫逃避策略，它在宿主中持續存在，并在有利的條件下重新激活致病性[20]。

根據定義，結核分枝桿菌的休眠期即潛伏期是指在宿主內持續存活多年而不引起臨床疾病或在結核菌素試驗中顯示反應性的生物體的臨床病癥。在休眠期間，結核分枝桿菌局限于由宿主免疫細胞聚集組成的肉芽腫中，肉芽腫防止結核菌擴散，此時結核菌的特征是體外生長緩慢，代謝途徑減少，染色特征改變，不能在固體培養基上培養，以及對抗結核病治療藥物的抗性。通過這種休眠狀態逃脫宿主的免疫反應從而在宿主細胞中存活，并在有利條件下重新恢復活性。

休眠期的結核分枝桿菌處于脂質負載的巨噬細胞內，結核菌的復制受到嚴重抑制。有研究表明，在多種壓力下，轉錄/翻譯裝置中總體活性的降低。例如，rhlE(ATP依賴性RNA解旋酶同源物)被阻遏，表明轉錄機制中活性降低。ATP合酶亞基的基因表達被抑制，表明細胞中ATP生成的主要關閉；同時，有氧呼吸被顯著抑制。此外，厭氧呼吸所需的基因(frdA，narG/H/X，nirA)持續表達(圖1)[33]。

在缺氧刺激下，脂質負載的巨噬細胞內的結核菌積累中性脂質，失去耐酸性，同時產生抗生素耐藥性。抗生素耐藥性的發展被稱為“表型耐藥”或“耐藥”，通過細菌對抗生素的通透性下降，抗生素的外排，抗生素的修飾以及多個基于靶標的耐藥性突變的逐步積累等產生的[34]。當結核分枝桿菌進入休眠非復制狀態的能力，具有非常低的代謝活性和對現有抗結核藥物的表型耐藥性[35-36]。

2.2 脂肪酸在休眠期的來源休眠期的結核桿菌位于肉芽腫組織包裹中，環境中脂肪酸和膽固醇富集，并處于缺氧環境下。有證據表明，脂肪酸是病原體在休眠期長期存活所使用的能源[36-37]，因此，在通過模擬缺氧和不治療、應激等條件下，研究細菌內脂肪酸來源。通過放射性標記宿主脂肪酸，觀察到其從宿主細胞轉移到結核分枝桿菌中，并合成甘油三酯。脂質負載巨噬細胞內結核分枝桿菌內積累的甘油三酯主要是通過結核分枝桿菌tgs1基因產物將宿主脂源性脂肪酸重新酯化成甘油三酯合成的[38]。同時，在多重壓力下，編碼乙醛酸循環酶的基因，例如異檸檬酸裂合酶(ICL或aceA/Rv0467)和檸檬酸合酶(gltA1/Rv1131c)表達顯著增加(圖1)[33],表明脂肪酸合成增加，脂肪酸為休眠期結核菌的重要能量來源。

圖1 微陣列分析顯示乙醛酸循環、NAD再生和能量代謝相關基因表達的變化[33]

2.3 休眠期脂肪酸的利用在休眠期，結核分枝桿菌將脂肪酸作為重要碳源，將宿主來源的脂肪酸用于3個主要方面。

2.3.1支持中樞新陳代謝 與處于感染期的情況類似，休眠狀態下的結核分枝桿菌也利用脂肪酸作為其重要碳源之一。由于處在低氧高脂質下，造成了肉芽腫內部其他營養物質缺乏，利用脂肪酸維持中樞系統的新陳代謝更加重要。處于休眠狀態下的結核分枝桿菌基本不進行復制，其生長水平及分裂狀態都非常緩慢，使休眠期的結核分枝桿菌的代謝出現一定程度的改變。同時，以脂肪酸為基底之一合成的甘油三酯作為休眠期結核分枝桿菌生長的能量來源[39]。同時，膽固醇也是菌體的重要能量源，但膽固醇代謝會對菌體代謝造成很大負擔，結核分枝桿菌利用增加脂肪酸的含量來作為緩沖，利用脂肪酸和膽固醇共同代謝來確保菌體代謝平衡[40]。

2.3.2作為酰基引物產生與毒力相關的次生代謝物 與處于感染期的結核分枝桿菌相似，休眠期的病原體利用脂肪酸產生毒力所需的重要生物前體。例如脂質小體，是一種普通培養基中通常存在的脂肪物質,含有多聚β-羥基烷酸酯、甘油三酯和蠟酯。脂質小體更常見于結核分枝桿菌的休眠期,這也是休眠期結核菌表達脂質小體被認為是導致表型耐藥的原因[41]。

2.3.3支持細胞膜完整性和創建碳儲存分子[42]與感染期相似，脂肪酸通過降解、延伸和與其他物質合成結核分枝桿菌所必須的成分，維持細胞膜完整性。同時，轉化為甘油三酯，作為能量儲存。

在感染期，結核分枝桿菌利用脂肪酸作為碳源進行分裂增殖，侵染更多的巨噬細胞，同時也是細胞毒力的來源之一。但在休眠期，結核分枝桿菌分裂增殖基本停止，對脂肪酸的利用也轉變為在巨噬細胞體內持續存活，提供結核分枝桿菌產生表型耐藥的所需物質。結核分枝桿菌同時利用脂肪酸產生甘油三酯，并消耗甘油三酯為菌體供能。

3 脂肪酸作為結核分枝桿菌治療新靶點的相關進展

3.1 脂肪酸是生物被膜的主要機制成分脂肪酸作為結核分枝桿菌治療靶點的探究方向的提出，主要基于研究者們對生物被膜的研究和發現。細菌通過形成一個細胞群體的策略在不同環境條件下存活，這樣的細胞群體就是生物被膜。超過80%的細菌感染存在生物被膜過程，病原菌通過這種生長方式長期留在宿主體內，躲避免疫系統和各種微生物治療的清理作用，發展成為持續感染狀態[43]。生物被膜作為人類感染的重要致病因素[44]，越來越引起人們的重視，也是近年來慢性疾病致病機制不可忽視的研究要點。而結核分枝桿菌也能夠形成生物被膜。目前已經得知，結核分枝桿菌的生物被膜基質成分主要包括多糖、eDNA、蛋白和脂質等[45]。脂肪酸作為細菌細胞壁脂質的主要組成部分和主要供能來源，對其的的研究足以作為藥物靶點是新的治療策略。

3.2 以脂肪酸為主體作為結核分枝桿菌靶點治療的研究結核桿菌的細胞壁組成成分包含肽聚糖、阿拉伯半乳糖和MA。MA作為自然界重最大的脂肪酸，不僅在細胞壁干重占到了40%～60%的比例，也是結核桿菌細胞膜外層的基礎。分枝菌酸的合成主要是在FASⅠ和FASⅡ 的相互作用之下。

此外，MA結構功能的改變也能影響結核桿菌在巨噬細胞中的生長狀態。MA的合成與裝配是可以為結核病的化學藥物治療提供許多潛在功能靶位的。烯酰ACP是MA合成中必經步驟的組成部分，已經被證明是抗結合治療的重要藥靶[46]

目前，人們采用的抗結核一線藥物異煙肼，其主要的作用靶點是MA生物合成酶InhA,多聚磷酸鹽polyP調控分枝桿菌的生理過程。其中也包括結核分枝桿菌生物被膜的形成。polyP能夠影響到分枝桿菌對異煙肼的敏感性[47]。研究表明，poly P的缺失能夠影響分枝桿菌生物被膜的形成能力，主要是能改變細菌表面的脂質成分[48]。不難推斷出polyP或許影響分枝菌酸的代謝進一步影響了分枝桿菌生物被膜的形成。此外，polyP的缺失可導致C16和C17這些短鏈脂肪酸，也就是FASⅠ合成酶系統產生的中間產物，在生物被膜成熟時期呈現顯著性缺乏。很多研究證明，結核分枝桿菌的持留性也與ployP有關，其代謝酶也可作為潛在的藥物靶點[49]。比如以多聚磷酸鹽激酶2作為藥物靶點而設計出的新型藥物[50]。

結核分枝桿菌的HupB蛋白主要定位在細胞膜上，與生物被膜形成的缺失和非極性的脂質譜改變相關。FASⅡ系統中的ACP轉化酶(MCAT)也是脂肪酸代謝中的重要步驟。所以對于脂肪酸作為靶點治療重點的研究，也可以深入到以具體蛋白位點或者蛋白表達為突破點。

4 展望

結核病是有記錄以來人類最古老的疾病之一，盡管目前有減毒活疫苗和幾種藥物治療結核，但它仍然是一種慢性的、危害嚴重的人畜共患傳染病。結核分枝桿菌在感染期和休眠期的生長狀態，繁殖及感染性存在較大差異，這種差異造成了對結核分枝桿菌研究的困難。脂肪酸是大多數生物體內所必需的物質，也廣泛存在于結核分枝桿菌內。結核分枝桿菌將脂肪酸作為較穩定的能量來源，利用脂肪酸控制細胞壁的通透性，雖然處于不同時期的結核分枝桿菌的生理特性存在明顯差異，其脂肪酸產生方式也存在差異，但對脂肪酸的利用等具有相似性。同時，目前證實控制細菌所采用的Ⅱ型脂肪酸合成系統的相關基因是保守且必不可少的，其中關鍵步驟所使用的同工酶執行的酶促反應相似[34]。

目前，圍繞脂肪酸的形成以及其中涉及到的相關生化反應過程，如FASⅠ與FSAⅡ系統中涉及到的相關蛋白表達與位點的變異，這些都可以為脂肪酸作為結核分枝桿菌治療的新靶點提供依據，為結核病的治療提供新的途徑。此后，也可以著眼于脂質形成的過程，細菌對于脂肪酸的利用與生產過程，或者其中涉及的相關酶蛋白表達或者是控制相關蛋白表達的具體位點基因，都可以作為新靶點尋找的重點。