蘇卡達陸龜尿酸的固體成分和尿結石的性狀及顯微結構觀察

丁荔佳,成 奇,潘連德,3 *,徐金鋮,劉宇婷

(1.上海海洋大學 上海省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2.上海綺異動物專科醫院，上海 200335；3.上海海洋大學 國家水生動物病原庫，上海 201306)

尿酸是蘇卡達陸龜(Centrochelyssulcata)等爬行動物排泄含氮廢物的主要成分，與陸龜尿結石的形成有著密切關系[1]，陸龜血液的尿酸指標能夠評估陸龜的營養狀況[2]，陸龜性別、種類、季節也影響尿酸的形成和排泄[3]。蘇卡達陸龜、印度星龜(Geocheloneelegans)等幾種易產生結石的沙漠型陸龜在正常代謝時存在排泄尿酸的行為[4]，其較大的膀胱有著儲存尿液、濃縮尿液、循環利用水分的能力，與水龜、半水龜相比，沙漠型陸龜有著更大的膀胱，對尿液中水分重吸收的能力更強[5]。儲存于野生和人工養殖陸龜膀胱中的尿酸會形成尿酸鹽固體成分[1]，陸龜代謝正常時，尿酸鹽固體成分會隨著尿液排出體外，當陸龜代謝異常時，尿酸鹽固體成分在尿結石核子如細菌、壞死細胞和組織等尿道異物的影響下會在膀胱內形成尿結石。微小的尿結石隨著尿液排出體外，則不會影響陸龜的生長，否則，尿結石在膀胱中越長越大，就會患尿結石癥。陸龜患尿結石癥后，常表現出厭食、精神萎靡不振、不愿爬動、常做排便姿勢但尿液和糞便排泄困難、后肢或泄殖腔腫脹等臨床癥狀[2,6-7]。當較大的尿結石位于泄殖腔并堵塞尿道口或肛門口時，會導致糞便堵塞性腸梗阻，造成陸龜死亡[1-2,5,7-8]。尿石癥最常見于生活在原始干旱氣候環境中的陸龜，如蘇卡達陸龜[1-2,7]、沙漠地鼠龜(Gopherusagassizii)[6,9]常發此癥。通過X射線和 CT影像學技術檢驗，可查明尿結石在陸龜體腔中的位置、大小及其數量[2]。臨床實踐中，通過中指自泄殖孔插進泄殖腔并觸摸內容物，或雙手指通過后肢股前窩觸摸體腔，也可初步檢查尿結石及其大小。陸龜患尿結石癥后通常需要外科手術，根據病龜大小、尿結石在病龜體腔中的位置和大小，可選用泄殖腔碎石手術[7]、腹部開甲手術[1,5,8,10]、跨窩軟組織切開術[2,7]等方法去除尿結石。尿結石取出來后，可通過定性定量多種分析方法測定其成分[11]以揭示尿結石的屬性。為深入了解蘇卡達陸龜尿酸和尿結石的性狀和結構開展本研究，以期為陸龜人工養殖和尿石癥的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及其尿酸和尿結石樣品的采集、處理和保存尿酸樣品采自海南省?？阢r業養殖公司的 20只人工養殖蘇卡達陸龜(圖1A)，體寬 45 cm 左右，體長 54 cm左右，體質量約30 kg，成年種龜編號 1～20號(圖1A)。蘇卡達陸龜及其尿結石來自上海綺異動物?？漆t院，編號為 21 號(圖2A)和 22 號，均為雌性，體質量為 2.8 kg，病龜均厭食多日，精神萎靡不振，泄殖腔腫脹，多日未排除尿酸和糞便。在晴天上午 8:00-10:00 和下午 2:00-4:00 采集2次樣品，用吸管吸取剛排出未被污染的尿酸，手術刀刮去表面污染區域后，湯勺挖取牙膏狀尿酸；對于自然條件下風干的尿酸樣品，采集時挑選形態較為完整，未被污染的部分，再用自來水清洗過濾除去雜質后暫存于 50 mL的離心管中。對采集后的樣品預處理和臨床觀察，挑選出20 份，依次編號1～20 號，常溫保存。樣品帶回實驗室后，經 80℃立式鼓風干燥箱(HTG-9240A)內干燥 24 h，從中選出3類(圖1B,C,D)6 個尿酸樣品(3，4，5，6，7，15 號)，對樣品進行觀察、采集照片和匯總特征。21號和22號蘇卡達陸龜患尿結石癥后，通過 X光照片確定尿結石在病龜體內的位置、大小(圖2B)，然后在無菌環境中進行腹部開甲手術取石(圖2C)。術后取出的尿結石用自來水沖洗，去除污物及血漬，稱測質量，分割，取其體積的 1/8，用手術刀和鑷子將21號樣品按照“樹輪”由外到內分層剝離成10層暫放于培養皿中，核心層記為 Core，核心層由內到外按層依次記為L1～L10(圖3)。

A.3 號蘇卡達陸龜一邊進食一邊排尿酸(↑);B.蘇卡達陸龜液體或膠狀尿酸(↑)；C.蘇卡達陸龜半固體或牙膏狀尿酸(↑)；D.蘇卡達陸龜自然風干后的尿酸固體(←)

A.患尿結石癥的 21號蘇卡達陸龜;B.X光照片顯示出尿結石(←)；C.膀胱中尿結石(←)；D.取石手術后的狀態

Core.核心層為空；L1.第1層；L2.第2層；L3.第3層；L4.第4層；L5.第5層；L6.第6層；L7.第7層；L8.第8層；L9.第9層；L10.第10層，即最外一層。放大倍數.4.16倍

1.2 蘇卡達陸龜尿酸的固體成分和尿結石掃描電鏡樣品處理及觀察尿酸的固體成分和 21號尿結石分層樣品及 22號尿結石隨機樣品處理為 0.3 cm3的小塊，置于掃描電鏡樣品盤上的導電膠固定(圖4A,C)；將樣品放入離子濺射裝置(E-1010，日立)內抽真空，電壓控制在 4 V 以下，16 min 后進入噴金模式(圖4B,D)，50 s 后將樣品取出置于掃描電子顯微鏡(S3400，日立)載物臺中，調試參數，觀察并采集圖片。

A.固定于掃描電鏡樣品盤導電膠上的 6 個尿酸固體成分和 2 個尿結石樣品；B.噴金后的 8 個樣品；C.固定于掃描電鏡樣品盤導電膠上的 21 號尿結石分層樣品；D.噴金后的 21 號分層樣品

2 結果

2.1 蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分性狀和結構

2.1.1尿酸及其固體成分眼觀性狀和結構 蘇卡達陸龜排出的尿酸有白色、乳白色、黃色等顏色，其形態各異，有的稀薄、有的黏稠呈半固體狀。尿酸放置在樣品管中會形成半固體或固體(圖5A,C)，在自然狀態下風干會形成固體(圖5E)，高溫干燥后全部形成固體(圖5B,D,F)，其質地松脆，顏色略有改變(表1)。

A.干燥前的 15 號樣品,部分表面呈黃色(↑)；B.干燥后的 15 號樣品，部分邊緣呈微黃色(↑);C.干燥前的 3 號樣品，部分邊緣呈卷曲狀(←)；D.干燥后的 3 號樣品；E.干燥前的 5 號樣品，部分剖面呈淡黃色(←)；F.干燥后的 5 號樣品，部分剖面呈淡黃色(←)

表1 6個蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分樣品的形態變化

2.1.2蘇卡達陸龜尿酸固體成分的掃描電鏡結構特征 在掃描電鏡 24倍鏡下，6個尿酸樣品的固體成分均為表面粗糙石塊狀(圖6A)。在 100倍和 500倍鏡下，3號樣品為片狀和顆粒狀結構混合物(圖6B)，4號樣品為片狀和石礫狀結構混合物(圖6C)，5號樣品為片狀和顆粒狀結構混合物(圖6B)，6號樣品為顆粒狀結構混合物(圖6D)，7號樣品為火山巖狀結構(圖6E)，15號樣品為顆粒狀結構混合物(圖6D)。在 1 000～4 000倍鏡下，3號樣品為煤渣狀結構混合物(圖6F)，4號樣品為碎石狀結構(圖6G)，5號樣品為片狀(圖6H)和煤渣狀結構混合物(圖6F)，6號樣品為海綿狀結構(圖6I)，7號樣品為海綿狀結構(圖6I),15號樣品為煤渣狀結構混合物(圖6F)。

A.3號樣品，24×，表面粗糙石塊狀；B.3 號樣品，500×，片狀和顆粒狀結構混合物;C.4 號樣品,500×,片狀和石礫狀結構混合物；D.6 號樣品,100×，顆粒狀結構混合物;E.7 號樣品，500×，火山巖狀；F.3 號樣品，2 000×，煤渣狀結構；G.4 號樣品，2 000×，碎石狀結構;H.5號樣品，2 000×,片狀結構;I.6 號樣品，3 000×，海綿狀結構

2.2 蘇卡達陸龜尿結石性狀和結構

2.2.1蘇卡達陸龜尿結石眼觀性狀及結構 21號蘇卡達陸龜尿結石剛取出時，形態呈圓球狀，比乒乓球稍大，直徑 50 mm，質量 40 g(圖 7A)；22 號樣品呈橢圓形狀，長徑 58 mm，短徑 53 mm，質量 45 g。尿結石表面粗糙，如同月球表面，質地硬。21號尿結石取出后用鋼鋸對其按總體積的1/2切割(圖7B)、1/4切割、1/8切割(圖7C)切開，用自來水沖洗后的剖面呈樹輪狀分層，表面有大量分布不均的空隙，每層尿結石面積不均，形態各異，由灰色、白色、乳白色、少量淺紅色、淡黃色等顏色組成，核心層(Core)為空，由內到外按層依次記為 L1～L10，在解剖顯微鏡(OLYMPUS，SZ61)4.16 倍觀察分層結構(圖3)。

A.手術取出的尿結石和乒乓球合照；B.1/2切割清洗過的尿結石(中間)；C.1/8切割清洗過的尿結石

2.2.2蘇卡達陸龜尿結石的掃描電鏡結構特征 在掃描電鏡 24倍鏡下, 21號蘇卡達陸龜尿結石分層樣品 L1～L10及 22號尿結石隨機樣品均為表面粗糙石塊狀(圖 8A)。在 100倍和 500倍鏡下，L1層為泥沙和顆粒狀結構混合物(圖 8B)，L2層為泥沙和網狀結構混合物(圖 8C)，L3-L7層為泥沙和煤渣狀混合物(圖8 D)和珊瑚石狀結構(圖8 F)，L4層為泥沙狀混合物(圖 8E)，L5層為珊瑚石狀結構(圖 8F)，L6層為泥巴和泥沙混合物(圖 8G)，L8層為泥巴和泥沙混合物(圖8G)及泥沙狀混合結構(圖8E)。500倍鏡下，22號樣品隨機層為煤渣狀結構(圖8H)。在1 000～4 000倍鏡下，L5層為海綿狀結構(圖 8I),L9層為紫菜狀結構(圖 8J)，L10層為煤渣狀和纖維狀混合結構(圖8K),L3 層為海綿狀結構(圖8L)。

A.21號樣品，L2層，24倍，表面粗糙石塊狀；B.21號樣品，L1層，500×,泥沙和顆粒狀結構混合物；C.21號樣品，L2層，500×,泥沙和網狀結構混合物；D.21號樣品，L3層，100×,泥沙和煤渣狀混合物；E.21號樣品，L4層，×100,泥沙狀混合物；F.21號樣品，L5層，500×,珊瑚石狀結構；G.21號樣品，L6層，100×,泥巴和泥沙混合物；H.22號樣品，隨機層，500×,煤渣狀結構；I.21號樣品，L5層，4 000×,海綿狀結構;J.21號樣品，L9層，1 000×,紫菜狀結構;K.21號樣品，L10層，2 000×,煤渣狀和纖維狀混合結構;L.21號樣品，L3層，1 000×海綿狀結構

3 討論

3.1 蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分和尿結石的特征陸龜尿液中會積累大量的尿酸，和尿液一樣尿酸也是陸龜[9]、蜥蜴、蛇、鱷魚[12]等爬行動物排氮的主要形式，其尿酸在尿液中積累、轉化后會形成尿酸鹽或固體顆粒，受尿液pH的影響，尿酸以液體狀尿酸或半固體尿酸鹽的形式排出體外[13]。由于尿酸成分及其濃度的變化，新鮮尿酸排泄物會有豆漿狀、膠狀、牙膏狀、石礫狀等各種各樣的形態，尿酸排出后，經自然風干或高溫干燥后會變成表面粗糙的石塊狀。在掃描電鏡下，尿酸固體成分有表面粗糙石塊狀、片狀、顆粒狀、石礫狀、細沙狀、火山巖狀、泥巴狀、煤渣狀和海綿狀等多樣化結構特征，與犬的4種尿結石的性狀和掃描電鏡結構不同[14]。蘇卡達陸龜膀胱中的尿結石呈球體或橢圓形狀[1,2,5]，表面粗糙，質地松散，有大量分布不均的空隙，剖面像樹輪一樣逐層增長；每層尿石面積不均，形態各異[2]，由乳白色、黃色、棕色等多種顏色組成，與軍曹魚(Rachycentroncanadum)[15]膀胱中的尿結石形態相似。

3.2 蘇卡達陸龜尿酸的固體成分及其尿結石的關聯蘇卡達陸龜將尿酸和尿液儲存在膀胱中，缺水時，若其膀胱內的尿酸和尿酸鹽不能及時排出體外就會在體內積聚形成尿結石[7]。蘇卡達陸龜尿酸固體成分為質地松脆易碎的不規則固體、顆粒狀固體、團狀固體及塊狀固體，其中粉砂狀和顆粒狀的形態與波爾山羊和水牛膀胱結石形態類似，與質地堅硬、外觀呈球形或橢圓形、內部結構呈樹輪狀分層[2]的蘇卡達陸龜尿結石形態存在差異。在掃描電鏡下，蘇卡達陸龜尿酸樣品固體成分結構與尿結石各層掃描電鏡結構有部分相似之處，但蘇卡達陸龜尿結石無片狀、石礫狀、細沙狀、火山巖狀等結構，其主要原因是蘇卡達陸龜尿結石在膀胱內的形成是由無數尿酸鹽和尿結石形成因子共同組成，而尿酸鹽是尿酸的主要固體成分[16-19]。波爾山羊尿結石由少量柱狀晶體和多種形態的顆?；旌衔锝M成[20]，水牛尿結石由細小顆粒和斜方柱狀晶體混合組成[20-21]，與蘇卡達陸龜尿結石掃描電鏡結構不同。

3.3 蘇卡達陸龜尿酸的健康管理和預防尿結石的臨床建議蘇卡達陸龜對于養殖環境中的溫度、濕度、光照和食物有獨特的要求，它們依靠環境的熱量和自身行為來調節適宜體溫。在日常管理中，建議環境溫度保持在 26～30℃，濕度保持在 40%～80%，食物以高纖維、高鈣、低磷、低蛋白、低水分的水果蔬菜為主。為促進陸龜對鈣質的吸收，飼養場應配備全光譜太陽燈，天氣好時帶龜曬太陽，做運動，在龜場水池泡澡，以促進陸龜排出尿酸，避免形成尿結石。日常管理應注意觀察蘇卡達陸龜排除尿酸的數量和性狀，若發現有尿酸排泄減少、有尿結石顆粒排出或狀態不好的情況，應對其仔細檢查，及時排除病因，以防止尿石癥發生，蘇卡達陸龜一旦確診為尿石癥，應及時就醫[2,5]。