皮質醇對LPS損傷的奶牛子宮內膜上皮細胞修復機制的影響

董俊升，王雅麗，方 麗 ，孫法壯，崔璐瑩，王 亨，李建基 *

(1.揚州大學 獸醫學院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；2.教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 揚州 225009)

子宮內膜對哺乳動物的生殖起著至關重要的作用，影響生殖周期、著床、妊娠等，且能夠抵御病原菌的入侵。子宮內膜上皮細胞是子宮內膜的最外層，直接與外界環境接觸，在分娩以后子宮內膜上皮細胞受到破壞，并且在此時幾乎所有奶牛的生殖道都會被細菌污染，可導致奶牛子宮炎與子宮內膜炎[1-2]。因此，產后奶牛子宮內膜上皮細胞(BEECs)的快速修復對子宮內膜恢復正常的生理功能有著重要意義。大腸桿菌是引起奶牛子宮內膜炎最常見的致病菌，脂多糖(LPS)是其致病性內毒素的主要成分[3]。已有研究報道，用1 mg/L LPS可制作奶牛子宮內膜上皮細胞和基質細胞的炎性損傷模型[1]。

組織的修復涉及炎癥消退、血管生成、組織重塑和新組織的形成[4]。上皮細胞、基質細胞、白細胞等產生的生長因子，參與修復過程，主要的生長因子有TGF-β、CTGF和VEGF。TGF-βs調控多種細胞的增殖和分化，促進胚胎發育、傷口愈合及血管生成，并且TGF-β1是CTGF的強效誘導劑[5]。CTGF對子宮內膜的修復有明顯的促進作用。在增殖期的子宮內膜腺上皮細胞和基質細胞中的CTGF蛋白表達水平明顯升高[6]。VEGF是促進血管生成的調控因子，它可以增加血管的通透性，促進細胞遷移[7]。Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路對細胞的增殖、代謝、生存和侵襲等方面都有調控作用[8-9]。近幾年，很多研究已經發現Wnt/β-catenin通路參與子宮內膜上皮細胞的生長修復進程[10]。

皮質醇作為一種內源性糖皮質醇激素，對維持機體的生理活動是必須的。但是，在奶牛圍產期期間，由于受到多種應激刺激，如妊娠應激、分娩應激、泌乳應激等，奶牛體內皮質醇濃度會出現較大范圍的波動[11-12]。目前，系統分析生理濃度和病理濃度的皮質醇水平對奶牛子宮內膜上皮細胞增殖作用的研究較少，因此本研究選用不同濃度的皮質醇與LPS共同處理原代奶牛子宮內膜上皮細胞，觀察在奶牛子宮內膜上皮細胞發生炎性損傷時皮質醇對Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路以及多種生長因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF基因表達的影響，為深入了解產后奶牛子宮內膜的修復機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM/F12培養基、鏈蛋白酶、LPS(O111：B4)和皮質醇均購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；胰蛋白酶購自Amresco公司；兔源一抗C-Myc、CyclinD1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、β-actin和山羊抗兔二抗均購自CST公司；兔源一抗β-catenin購自Abcam公司；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；TRIzol購自北京全式金生物有限公司；熒光定量PCR儀和蛋白電泳系統均購自Bio-Rad公司；化學發光成像分析系統購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 奶牛子宮內膜上皮細胞培養采集健康的奶牛子宮角并置冰盒中，帶回實驗室進行以下處理。用碘伏、75%酒精對子宮外表進行消毒，無菌條件下將子宮角切成3～4 cm的小塊。用含有500 U/mL青霉素和500 U/mL鏈霉素的PBS反復沖洗，直至清澈。縱向將子宮角切開，暴露子宮內膜組織，放入0.1%鏈蛋白酶中，4℃ 消化18 h[13]。消化結束后，刮取子宮內膜上皮細胞，置于PBS中，1 200 r/min離心5 min,棄上清，重復3次后，加入完全培養基，接種到細胞瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。24 h后換新的培養液，進行常規培養、傳代。

1.3 熒光定量PCR檢測生長因子的基因表達將奶牛子宮內膜上皮細胞接種到6孔板中，待細胞達到80%融合，棄掉培養液。對照組加入基礎培養液培養，LPS處理組加入含1 mg/L LPS的基礎培養液處理，皮質醇處理組加入分別含5,15,30 μg/L皮質醇與1 mg/L LPS的基礎培養液共處理。在3,12,18 h時收集細胞，加入TRIzol試劑，根據試劑盒說明書提取細胞總RNA，吸光度(D260/D280)應在1.8～2.1之間，取900 ng RNA反轉錄成cDNA，進行熒光定量PCR反應。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 30 s，共40個循環。反應體系：SYBR Green mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，無核酸酶水補至25.0 μL。生長因子TGF-β1、TGF-β3、CTGF、VEGF及內參β-actin的特異性引物序列見表1。

表1 奶牛子宮內膜上皮細胞目的基因引物序列

1.4 Western blot檢測Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路關鍵蛋白的表達將奶牛子宮內膜上皮細胞接種到細胞培養皿中，待細胞融合后棄掉培養液。對照組加入基礎培養液培養，LPS處理組加入含1 mg/L LPS的基礎培養液處理，皮質醇處理組加入分別含5,15,30 μg/L的皮質醇與1 mg/L LPS的基礎培養液共處理。30 min后收集細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質量濃度，并將各組蛋白質量濃度調至一致。取20～30 μg蛋白進行電泳，轉印到PVDF膜上。PVDF膜于5 %脫脂乳中封閉1 h,放入相應的一抗中，4℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜，二抗室溫孵育1 h。TBST洗滌后ECL發光拍照，并用Image J軟件對圖像灰度值進行分析。

2 結果

2.1 皮質醇對LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞TGF-β1、TGF-β3、CTGF和VEGF mRNA表達的影響5,15,30 μg/L皮質醇與LPS處理細胞后，熒光定量PCR法檢測各生長因子mRNA的相對表達量。如圖1所示，與空白組相比，LPS處理細胞后極顯著增加了TGF-β1和TGF-β3 mRNA的表達(P<0.01)。與LPS組相比，在3和12 h時，各質量濃度的皮質醇顯著降低TGF-β1 mRNA 的表達(P<0.05)，在18 h時，5，15 μg/L皮質醇極顯著降低TGF-β1 mRNA的表達(P<0.01)；在3，12，18 h時，各個質量濃度的皮質醇均極顯著抑制TGF-β3 mRNA的表達(P<0.01)(圖1A，B)。與空白組相比，LPS處理后對VEGF mRNA的表達沒有顯著影響。與LPS組相比，在12 h時，15 μg/L皮質醇顯著增加了VEGF mRNA的表達(P<0.05)，在18 h 時，15，30 μg/L皮質醇均顯著增加VEGF mRNA的表達(P<0.05)(圖1C)。與空白組相比，LPS處理12 h時，CTGF mRNA表達量顯著降低(P<0.01)，但在18 h時，其表達量極顯著升高(P<0.01)。與LPS組相比，在18 h時，各個質量濃度皮質醇處理組CTGF mRNA的表達量均極顯著降低(P<0.01)(圖1D)。

與對照組相比，*示差異顯著(P<0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)；與LPS組相比，#示差異顯著(P<0.05)，##示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 皮質醇對LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞Wnt/β-catenin通路的影響由圖2可知，LPS處理奶牛子宮內膜上皮細胞后，與對照組相比，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的蛋白表達水平顯著性升高(P<0.05)，表明LPS處理30 min后可以誘導奶牛子宮內膜上皮細胞Wnt/β-catenin通路的活化。與LPS組相比，15，30 μg/L皮質醇均顯著降低β-catenin的表達水平(P<0.05)，30 μg/L皮質醇顯著抑制C-Myc和CyclinD1的表達水平(P<0.05)，提示皮質醇能夠抑制由LPS誘導的Wnt/β-catenin通路的活化狀態。

圖2 皮質醇對LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞β-catenin、C-Myc、CyclinD1表達的影響

2.3 皮質醇對LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞PI3K/AKT通路的影響如圖3所示，LPS處理奶牛子宮內膜上皮細胞后，與對照組相比，PI3K和AKT的磷酸化水平極顯著升高(P<0.01)，可見LPS處理30 min后激活了奶牛子宮內膜上皮細胞PI3K/AKT通路。與LPS組相比，30 μg/L皮質醇顯著降低了AKT的磷酸化水平(P<0.05)。15，30 μg/L 皮質醇均顯著降低PI3K的磷酸化水平(P<0.05)。由此可見，皮質醇能夠抑制LPS誘導的PI3K/AKT通路的活化。

圖3 皮質醇對LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞PI3K和AKT磷酸化水平的影響

3 討論

分娩后，奶牛子宮內膜上皮細胞受到破壞，子宮內膜的快速修復對今后正常的妊娠具有關鍵作用。并且，子宮內膜上皮細胞在抵御外界病原微生物的入侵中起到天然屏障的作用。皮質醇參與多種生理功能的調控，例如生長增殖、免疫反應、機體代謝等。本試驗結果表明，皮質醇能夠降低LPS誘導的奶牛子宮內膜上皮細胞TGF-β1、TGF-β3和CTGF的基因表達，抑制LPS引起的Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化。

傷口愈合是一種高度有序和相互協調的進程，涉及到炎癥、細胞增殖、基質沉積和組織重塑。參與子宮內膜修復的生長因子主要有TGF-βs、VEGF和CTGF。研究表明，哺乳動物的TGF-β1和TGF-β3有64%～85%的氨基酸序列是一致的，大部分功能是相似的，但是也有一些區別，TGF-β1誘導皮膚組織的瘢痕化，TGF-β3可抑制這種效果[14]。CTGF是一種多功能生長因子，在多種細胞中都有表達，如在上皮細胞和分泌細胞有表達。在創傷修復期間，CTGF的表達量明顯升高，促進傷口愈合、結締組織細胞增殖及細胞黏附[5]。本試驗結果表明，LPS處理后細胞中TGF-β1和TGF-β3基因表達量均增加，這與之前的一些研究是相似的。鄧洋[15]證實LPS能夠引起奶牛子宮內膜上皮組織中TGF-β1的表達；GU等[16]證實LPS處理髓核細胞后，其TGF-β蛋白表達水平上升。細胞受到LPS刺激后，NF-κB由細胞質轉移至細胞核，誘導促炎因子的釋放，這些促炎因子能促進TGFβ信號的活化，導致TGF-β表達升高[17]。但是,糖皮質激素具有良好的抗炎效果，能夠抑制NF-κB通路，這也與我們的研究結果是相吻合。皮質醇處理后，能夠明顯抑制TGF-β1和TGF-β3的表達。據報道，LPS能夠直接引起肝星狀細胞增殖、遷移和細胞因子的產量[18-19]。CTGF在LPS處理前期呈下降趨勢，在18 h時出現升高趨勢，這可能是由于在炎癥前期以炎性損傷為主，后期CTGF表達增多，參與組織修復。當皮質醇處理細胞后，CTGF與TGF-β1和TGF-β3出現相似的結果，其基因表達抑制，說明皮質醇能夠抑制由LPS誘導引起的增殖反應。新血管的生成對子宮內膜修復是必要的過程。本試驗中VEGF基因的表達水平在LPS處理后沒有顯著變化，但是皮質醇處理后 VEGF基因的表達明顯升高。鄧洋[15]研究也證實LPS沒有導致奶牛子宮內膜VEGF表達量的明顯改變。OLLI等[20]報道，在人視網膜色素上皮細胞中VEGF的表達量可能不受炎癥的間接調控作用。當然，具體的原因有待進一步探討研究。

許多研究已經證實，Wnt/β-catenin涉及子宮內膜的修復，在子宮內膜上皮細胞再生時它處于動態的變化[21-22]。靜息狀態時，多數β-catenin結合在細胞膜表面，其余的β-catenin存在于細胞質中，與破壞復合體(Axin、APC、GSK-3β和CK1α)結合。β-catenin發生泛素化，被降解。一旦Wnt/β-catenin被激活，活化的Dsh抑制β-catenin降解，β-catenin在細胞質中聚集并進入細胞核，參與基因的調控。在研究中可以看到，LPS能夠促進β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表達，表明LPS激活了該通路。據報道，LPS能夠活化Wnt/β-catenin通路，促進細胞增殖[23]。皮質醇處理后，β-catenin、C-Myc和CyclinD1的表達均出現下降趨勢，并且在30 μg/L時其抑制效果最強。由此可見，皮質醇能夠抑制LPS激活的Wnt/β-catenin通路。β-catenin的磷酸化與PI3K信號通路也存在著關聯，抑制PI3K的活性，能導致β-catenin泛素化和降解。

PI3K/AKT信號通路在胞內信號傳導中有重要作用，調控細胞的增殖、黏附、遷移、侵襲、代謝和生存。PI3K是AKT的調控因子，能夠活化AKT，隨后AKT調控細胞的生長和生存。本試驗結果表明，LPS能夠促進PI3K和AKT發生磷酸化并激活該通路。但是，皮質醇處理以后能抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，抑制子宮內膜上皮細胞中PI3K/AKT通路的活化。據報道，LPS/TLR4信號傳導能觸發PI3K/AKT通路，增加細胞外基質產量，促進纖維化[24]。據報道，糖皮質激素能夠抑制LPS/TLR4信號，降低炎性反應[25]。由此可見，皮質醇能阻止TLR4與PI3K/AKT之間的信號傳導，抑制其活化。

綜上所述，皮質醇能夠抑制LPS誘導奶牛子宮內膜上皮細胞Wnt/β-catenin和PI3K/AKT通路的活化，阻止LPS促進生長因子TGF-β1、TGF-β3和CTGF表達量的上升。這可能會減少由于炎癥刺激導致的子宮內膜膠原沉積，避免子宮內膜過度的纖維化，同時，干擾了子宮內膜的修復進程。