JAK-STAT信號通路JAK2、STAT3和SOCS1基因在鴨腸炎病毒感染中各組織的表達變化

張 飄，龍立書，洪 猛*，華 敏，楊 霞，曾茂芹，劉妍罕，張揚子，楊 穎,5，溫貴蘭,5，程振濤,5，李 濤，文 明,5*

(貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.銅仁市動物疫病預防控制中心，貴州 銅仁 554300；3.黔東南州農業科學院，貴州 凱里,556000；4.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005；5.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；6.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550025)

Janus 蛋白酪氨酸激酶(Janus activated kinase，JAK)-信號傳導及轉錄激活因子(signal transductionand activators of transcription，STAT)信號途徑是DARNELL等[1]于1994年開展干擾素誘導細胞內信號傳導研究時發現的；該信號通路可被多種配體激活，參與細胞增殖、分化、存活和凋亡，可引起機體免疫失調、腫瘤生成和炎癥反應等過程[2]。當JAK通過受體二聚化或多聚化被激活后，引發STAT上特異性酪氨酸殘基磷酸化，導致STAT 蛋白構象改變并轉移到細胞核，與特定 DNA靶序列結合(如干擾素激活序列或干擾素激活反應元件位點)，從而調控細胞核數千個基因的轉錄[3-4]。研究發現，單純皰疹病毒(HSV)感染后，通過SOCS蛋白抑制JAK-STAT通路信號傳導，降低機體產生抗病毒因子以促進病毒增殖[5]；羊皰疹病毒(GTPV)感染后，激活機體細胞STAT3和SOCS1，抑制機體免疫應答反應，促進病毒復制[6]；牛皰疹病毒(BoHV-5)感染后，通過外殼蛋白UL41通過結合AREs區和STAT1 mRNA，阻斷JAK-STAT通路信號傳導，促進病毒增殖[7-8]。這些結果說明，JAK-STAT信號通路在皰疹病毒感染過程中發揮重要的作用，但同屬皰疹病毒科的鴨腸炎病毒(duck enteritis viral,DEV)與JAK-STAT信號途徑存在何種關系，目前尚未見到有關文獻報道。為此，本試驗在前期研究的基礎上，開展DEV感染對鴨機體組織JAK-STAT信號途徑關鍵分子表達的影響，以期為闡明JAK-STAT信號通路對DEV感染過程的影響機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 雛鴨和毒株30日齡健康雛鴨100只，購自貴州省三穗縣鴨場，經DEV核酸PCR和抗體ELISA檢測均為陰性；鴨腸炎病毒DEV-GZ株，由貴州省動物生物制品工程技術研究中心提供。

1.2 主要試劑和儀器TRIzol RNA分離試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNase H Plus),購自寶生物工程(大連)有限公司；JAK2、STAT3和SOCS1蛋白ELISA檢測試劑盒，購自上海撫生生物有限公司；細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜(0.2 μm)、JAK2兔單克隆抗體、辣根過氧化物標記山羊抗兔抗體等，購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 JAK2、STAT3和SOCS1基因熒光定量引物的合成根據本實驗室前期開展的鴨源JAK2、STAT3和SOCS1基因克隆結果[9]和建立相應的實時熒光定量PCR方法。鴨源JAK2、STAT3和SOCS1基因實時熒光定量PCR引物詳見表1。

表1 基因引物序列

1.4 DEV人工感染模型建立取雛鴨10只，隨機分為2組，Ⅰ組(試驗組)和Ⅱ組(對照組)，5只/組，隔離飼養10日，Ⅰ組腿部肌肉接種DEV-GZ株病毒液0.2 mL(1 000LD50)/只，Ⅱ組接種無菌生理鹽水0.2 mL，連續觀察其臨床癥狀并剖解觀察病理變化和PCR檢測病毒，驗證感染模型成功與否。

1.5 DEV人工感染與鴨組織樣本采集按照1.4感染模型的時間與方式，取雛鴨90只，Ⅰ組(45只)腿部肌肉接種DEV-GZ株病毒液，Ⅱ組(45只)接種無菌生理鹽水，于接種后12，24，36，48，7，84，96 h時捕殺試驗鴨，無菌采集組織樣本(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、法氏囊、胸肌和十二指腸)，每組每個時段各取6只(即6個重復)，―80℃保存備用。

1.6 JAK2、STAT3和SOCS1基因表達量與蛋白含量檢測

1.6.1感染鴨組織JAK2、STAT3和SOCS1基因檢測 取1.5的組織樣品，采用TRIzol法提取組織總RNA，按照PrimeScript RT Master Mix說明書步驟反轉錄成cDNA，以β-Actin基因為內參基因，采用JAK2、STAT3和SOCS1基因熒光定量PCR方法進行檢測，反應體系為10 μL：SYBR premix Ex TagⅡ(Tli RNase H Plus)5.0 μL,F/R 0.5 μL,ddH2O 3.0 μL,cDNA 1.0 μL，每個樣品3個重復。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，退火60℃ 30 s，39個循環。退火時采集熒光5 s，觀察分析不同時段感染鴨JAK2、STAT3和SOCS1基因的轉錄水平。

1.6.2感染鴨組織JAK2、STAT3和SOCS1蛋白檢測 取1.5的組織樣品，研磨勻漿后按50 mg量加入PBS 1.0 mL，混勻，3 000 r/min離心30 min，收集上清，按照檢測試劑盒說明書步驟測定上清JAK2、STAT3和SOCS1蛋白D450 nm值，代入按照標準品建立的標準曲線線性相關公式計算組織JAK2、STAT3和SOCS1蛋白表達水平。

1.7 感染鴨腸道組織JAK2、STAT3和SOCS1基因表達驗證選取本實驗室前期開展的DEV感染鴨十二指腸組織轉錄組測序結果[10]進行JAK2、STAT3和SOCS1基因mRNA轉錄水平的驗證；取上述試驗鴨十二指腸樣本組織，采用細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot，驗證十二指腸組織JAK2蛋白表達水平。

2 結果

2.1 人工感染結果經DEV人工感染后，Ⅰ組鴨出現精神沉郁、呼吸急促、排白色或綠色稀糞等臨床癥狀(圖1A1,A2正常對照)，剖解觀察可見感染鴨有典型的腸道環狀出血、腦膜充血出血、腎臟水腫出血等(圖1B1、C1、D1；圖1B2、C2、D2正常對照)，以DEV NP基因對肝臟組織DNA提取樣本進行PCR檢測，可見特異性DNA條帶(圖1E1)，而Ⅱ組鴨健康，剖解鴨內臟器官組織無明顯病變，PCR檢測為陰性(圖1E2)，說明本試驗成功建立了DEV人工感染模型。

A1.綠色稀糞；A2.糞便正常對照；B1.腸組織環狀出血帶；B2.腸組織正常對照；C1.腦組織充血、出血;C2.腦組織正常對照；D1.腎臟組織腫大、出血;D2.腎組織正常對照；E1,E2.M.DL2000 DNA Maker，-為陰性對照，+為陽性對照，其余為抽樣樣品，1～11.抽樣樣品

2.2 DEV感染鴨組織JAK2、STAT3和SOCS1基因轉錄變化選取健康雛鴨，人工感染DEV，采集不同時間感染鴨組織樣本，提取鴨組織器官總RNA，逆轉錄合成cDNA，以β-Actin為內參基因進行實時熒光定量PCR方法檢測分析鴨機體組織器官JAK2、STAT3和SOCS1基因轉錄水平，結果顯示DEV感染12～96 h時，JAK2基因在鴨心臟、脾臟、腦和肌肉中的轉錄水平總體呈現前期下調后期上調趨勢，而在鴨肝臟、肺臟、腎臟、胸腺、十二指腸和法氏囊中的轉錄水平總體呈現前期上調后下調趨勢(表2)；STAT3基因在感染鴨心臟、肝臟、法氏囊和肌肉中的轉錄水平總體呈現前期下調后期上調趨勢，而在感染鴨脾臟、肺臟、腎臟、腦組織、胸腺和十二指腸中的轉錄水平總體呈現前期上調后期下調趨勢(表3)；SOCS1基因在感染鴨心臟、肺臟、腎臟、腦組織、十二指腸、法氏囊和肌肉中的轉錄水平總體呈現上調趨勢，在感染鴨肝臟和腦中的轉錄水平總體呈現前期上調后期下調趨勢，而在感染鴨脾臟中的轉錄水平總體呈現前期下調后期上調趨勢(表4)。結果表明，DEV感染對鴨機體組織器官JAK-STAT信號通路相關基因JAK2、STAT3和SOCS1基因的轉錄水平均有不同程度的影響。

表2 未感染與DEV感染后不同時間各組織中JAK2基因的轉錄變化

表3 未感染與DEV感染后不同時間各組織中STAT3基因的轉錄變化

表4 未感染與DEV感染后不同時間各組織中SOCS1基因的轉錄變化

2.3 DEV感染鴨組織JAK2、STAT3和SOCS1蛋白表達變化采集如上人工感染DEV后不同時間的鴨組織器官樣本，研磨勻漿離心取上清，采用相應ELISA檢測試劑盒檢測分析JAK2、STAT3和SOCS1蛋白的表達水平，結果顯示DEV感染12～96 h，JAK2蛋白在感染鴨心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腦組織、胸腺、十二指腸、法氏囊和肌肉中的表達水平均低于Ⅱ組(表5)；STAT3蛋白在感染鴨心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腦組織、胸腺、十二指腸、法氏囊和肌肉中的表達水平亦低于Ⅱ組(表6)；而SOCS1蛋白在感染鴨心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、腦組織、胸腺、十二指腸、法氏囊和肌肉中的表達水平高于Ⅱ組(表7)。結果表明，DEV感染可下調鴨機體組織器官JAK-STAT信號通路中JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達水平，可上調SOCS1蛋白的表達水平。

表5 未感染與DEV感染后不同時間不同組織中JAK2蛋白的表達變化

表6 未感染與DEV感染后不同時間不同組織中STAT3蛋白的表達變化

表7 未感染與DEV感染后不同時間不同組織中SOCS1蛋白的表達變化

2.4 JAK2、STAT3和SOCS1基因轉錄水平及蛋白表達變化驗證經轉錄組測序分析顯示，感染鴨十二指腸JAK-STAT信號通路被激活，DEV感染24 h時SOCS1基因轉錄水平下調，而JAK2和STAT3基因轉錄水平不變(圖2)；DEV感染48 h時SOCS1、JAK2和STAT3基因轉錄水平不變(圖3)；DEV感染72 h時SOCS1和STAT3基因轉錄水平上調，而JAK2基因轉錄水平不變(圖4)；DEV感染96 h時SOCS1和STAT3基因轉錄水平上調，而JAK2基因轉錄水平不變(圖5)。經Western blot檢測(圖6)顯示，感染鴨十二指腸JAK2蛋白在DEV感染24，48，72，96 h時表達水平與ELISA檢測結果基本一致。

圖2 24 h時十二指腸轉錄水平

圖3 48 h時十二指腸轉錄水平

圖4 72 h十二指腸轉錄水平

圖5 96 h十二指腸轉錄水平

A.柱狀圖；B.印跡圖

3 討論

JAK-STAT信號通路是近年發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與機體內多個化學信號傳遞過程，如細胞凋亡、增殖分化以及炎癥發展等；該通路還能調節遺傳物質轉錄表達，是細胞內蛋白質之間相互作用的主鏈[11]，也是淋巴細胞發育的關鍵調節因子，維持T細胞活化和分化[12]。研究表明，在動物機體健康組織中JAK-STAT通路的信號傳遞受到良好的控制，可在細胞內不同水平上進行調節[13]；當動物機體受到病毒感染時，SOCS蛋白被特異性誘導高表達，抑制JAK-STAT通路信號傳導，從而促進病毒復制[14-15]，如艾滋病病毒(HIV-1)、甲型流感病毒(IAV)、日本乙型腦炎病毒(JBV)和丙肝病毒(HCV)等；同時JAK-STAT信號通路在某些因子刺激下發揮抗病毒作用，如干擾素-α(IFN-α)激活JAK-STAT信號通路后，可抑制丙型肝炎病毒增殖[16]。但是，JAK-STAT信號通路被激活后也會帶來一些不良反應，如：乙肝病毒(HBV)直接損傷腎組織機制可能與JAK-STAT信號通路被激活有關[17]、某些因子可通過JAK-STAT信號通路增強癌細胞增殖和侵襲能力[18]等。目前，國內有關鴨腸炎病毒(DEV)感染對鴨機體組織JAK-STAT信號通路的影響研究尚未見報道。因此，本研究開展DEV感染對鴨機體組織JAK-STAT信號途徑關鍵分子表達的影響，以期為闡明JAK-STAT信號通路對DEV感染過程的影響機制奠定基礎。

JAK-STAT信號通路進行信號轉導，從而以簡單而有效的方式激活細胞因子介導的細胞活化，其發出的信號在先天免疫反應和適應性免疫的起始和調節中起關鍵作用，而信號轉導與STAT，可以在跨膜受體和細胞核之間的直接通信，這時候STAT既作為細胞質信號蛋白，又作為核轉錄因子，同時具有多種靶基因，而當細胞因子與細胞膜上其特異性受體結合時，細胞質受體相關JAK的激酶活性被激活，激活的JAK磷酸化細胞因子受體的胞質結構域中的酪氨酸殘基以提供STAT的停靠位點，STAT通過SH2結構域結合細胞因子受體并且通過JAKs在酪氨酸殘基上磷酸化，導致通過SH2磷酸鹽相互作用形成同源或異源二聚體，二聚化的STAT隨后從細胞質轉移到細胞核中，在核中結合特定的DNA元件來調節細胞因子應答基因的表達[3-4]。同時，SOCS基因被誘導激活，從而抑制JAK-STAT信號傳導，除此之外SOCS1還含有額外的激酶抑制區(KIR)，來抑制JAKs的催化活性。本研究發現，感染DEV后，各組織中JAK2、STAT3和SOCS1基因的轉錄水平均有不同程度的變化，說明DEV感染有效激活了JAK-STAT信號通路中JAK2、STAT3和SOCS1基因轉錄，但在JAK2和STAT3基因轉錄后翻譯卻受到了抑制，這是否是SOCS基因激酶抑制區在發揮抑制作用，或者是SOCS1蛋白本身對JAK2和STAT3基因翻譯具有抑制作用，都需要進一步的試驗，但可以肯定的是SOCS1蛋白在JAK-STAT信號通路調控機制仍然為負調控。

研究發現，單純皰疹病毒感染會導致細胞內JAK-STAT信號通路的磷酸化程度降低，這其中可能是通過抑制JAK-STAT信號通路，從而降低抗病毒因子的產生[5]。SOCS1蛋白作為JAK-STAT通路負反饋調節蛋白，在病毒感染過程中呈現特異性的升高，認為SOCS1含量升高可能是導致宿主在抗病毒過程中反應突然衰弱的原因。隨后通過對SOCS1蛋白含量的上升調控，則可引起干擾素產生的減少，來促進病毒復制，這可能是通過SOCS1核轉位功能來影響SOCS1抑制干擾素的產生[9]，而HUO等[19]研究發現，維甲酸誘導基因1(RIG-1)可以促進干擾素的表達來防御DEV的感染，但RIG-1的表達又由STAT1介導，STAT1的表達和磷酸化直接影響RIG-1的抗病毒機制，STAT1與STAT3均為同一家族成員，是否SOCS1抑制STAT3的同時也抑制STAT1，從而導致STAT1表達或磷酸化被抑制，引起RIG-1的抗病毒機制和干擾素的表達減弱，從而表現出SOCS1抑制干擾素的產生，當然生物體進行防御是一個十分復雜的過程，這也許只是其中一部分。本試驗中DEV感染后雛鴨組織JAK2蛋白和STAT3蛋白的表達水平均下調，但SOCS1蛋白的表達水平呈現上調，從而使DEV感染鴨癥狀加重，這是否也是通過SOCS1核轉位功能來影響SOCS1抑制干擾素的產生，來促進DEV復制，需要進一步試驗來證明。楊穎等[20]研究表明，通過雛鴨腿部肌肉注射感染DEV后10 h內即均可檢測到肝臟、脾臟、腦、胸腺、腎臟和肺臟等組織中DEV的病毒含量，說明腿部肌肉注射DEV感染時間更短，而本試驗開始對JAK2、STAT3、SOCS1基因或蛋白進行檢測的時間為12 h，無法獲取DEV開始感染時JAK2、STAT3、SOCS1基因或蛋白的變化情況，但可以知道的是SOCS1蛋白抑制JAK-STAT通路信號，從而促進DEV的增殖。

轉錄組包括特定組織或細胞在某一時期內表達的所有RNA的集合,包括small RNA、lncRNA及mRNA等[21]，目前已經被廣泛應用于動物、植物、細菌、病毒等領域[22-23]。一直以來實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)都被作為是轉錄組測序結果驗證的方法之一，去證明轉錄組測序結果的可靠性。本試驗中JAK2、STAT3和SOCS1基因均可轉錄出成熟mRNA，并翻譯成蛋白質，而研究發現十二指腸是DEV感染重要靶器官[24]，基于這一點，本次選取十二指腸組織轉錄組測序和JAK2蛋白Western blot結果來對實時熒光定量PCR和JAK2蛋白ELISA檢測結果進行驗證，從而去驗證實時熒光定量PCR結果和ELISA檢測結果的可靠性。通過十二指腸轉錄組測序可以看出感染DEV后JAK-STAT信號通路會被激活，且JAK2、STAT3和SOCS1基因轉錄結果與實時熒光定量PCR結果一致，同樣的Western blot與JAK2蛋白ELISA檢測結果一致。

DEV感染可激活鴨機體組織JAK-STAT信號通路，且是從蛋白質水平上對JAK-STAT信號通路進行負調控；當JAK2和STAT3蛋白表達下調時，SOCS1蛋白表達水平上調，可能為SOCS1蛋白抑制JAK2和STAT3蛋白的表達，從而抑制JAK-STAT信號通路激活，來促進DEV的增殖。