鼠傷寒沙門菌sRNA GcvB與靶基因的作用機理分析

潘 永，楊 陽，段世宇，楊 琦,3*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

sRNA(small RNA)是長度為40～500 nt的主要調控基因轉錄后表達的短非編碼RNA，在原核生物中廣泛存在，此前相關研究主要集中于大腸桿菌和沙門菌[1]。多項研究結果表明，sRNA調控著多種基因，這些基因編碼與細菌生理、代謝、應激反應和群體感應等有關過程中涉及的蛋白質[2-5]。許多sRNA能夠調節多種靶mRNA，一種靶mRNA可受多個sRNA調節，從而形成了一個基于sRNA的復雜網絡，體現了它們在基因轉錄后調控中的重要作用。sRNA降低了細菌代謝所消耗的能量并提供了更緊密，更快速的基因調節，可幫助細菌適應新環境。sRNA GcvB是一段僅有206個核苷酸組成的短非編碼RNA分子，在細菌中比較保守，大腸桿菌和沙門菌gcvB基因RNA序列相似度高達95%。研究表明，GcvB主要調控沙門菌ABC轉運蛋白的表達[6]。GcvB通過3個特殊保守單鏈核苷酸序列R1、R2或R3與靶mRNA對應序列完全或部分堿基互補配對，從而抑制或促進mRNA的翻譯[7-9]。此前，僅探明GcvB直接調控30余種mRNA，相信還有大量GcvB靶基因未被挖掘。MIYAKOSHI等[10]最近在研究與鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium LT2，STM LT2)sRNA GcvB產生拮抗作用的mRNA 海綿SroC時，通過微陣列分析篩選到部分受GcvB調控的基因，但這些基因是否受GcvB直接調控目前尚未驗證。

研究表明，GcvB在細菌對數期早期表達量最高，隨著生長周期往后的推移，表達量水平下降直至穩定期幾乎檢測不到，因此本研究僅分析各基因轉錄水平在STM LT2對數早期時的變化[11]。本試驗根據GcvB特性，利用無痕基因重組技術構建STM LT2ΔgcvBR1、STM LT2ΔgcvBR2和STM LT2ΔgcvBR3菌株，并設計合成熒光定量PCR引物，通過相對熒光定量PCR技術檢測各基因在不同菌株中的轉錄水平變化，最后進一步分析各基因與GcvB 3個功能區的關系，旨在挖掘STM LT2 sRNA GcvB潛在靶基因并探明其與GcvB的作用方式，為闡明沙門菌致病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及主要試劑野生型STM LT2株被命名為3409(GenBank ID：AE006468.2)，STM LT2ΔgcvB株被命名為10241；無痕基因重組系統涉及質粒pKD46為同源重組的輔助質粒,含有溫度敏感復制子,37℃及以上培養可去除，20%阿拉伯糖誘導后能夠表達Gam、Beta和Exo 3個λ噬菌體重組酶；pKD3含氯霉素(cat)抗性基因，為重組轉化子提供篩選標志；以上所有材料均由法國國家科學研究中心(CNRS)分子遺傳學Bossi實驗室惠贈。Pfu和Taq DNA聚合酶均購自北京索萊寶科技有限公司;PCR產物純化試劑盒和RNA提取試劑TRIzol均購自上海生工生物有限公司;膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)以及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix皆購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成如表1所示，雙橫線表示堿基與3409 的基因序列同源，為無痕基因重組提供同源臂。單橫線標示堿基與pKD3質粒序列同源，其中gcvB-R與cat-F反向互補，cat-F與cat-R擴增得到氯霉素抗性(cat)基因序列，為無痕重組提供篩選標記。gcvBR1-F、gcvBR2-F和gcvBR3-F已分別刪除功能區R1(5′-GTGATGTTGTGTTGTTGTGTTTGC-3′)、R2(5′-ACTTCCTGT-3′)和R3(5′-TACCCTGTCTGTCCATAGTGATTAAT-3′)。無橫線引物中除aF和aR外皆為熒光定量PCR引物，本試驗以16S rRNA為內參基因，所有引物通過Primerselect軟件設計并由上海生工生物有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3 STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株的構建

1.3.1SOE-PCR結合Touchdown PCR制備無痕基因重組目的片段 通過SOE-PCR技術分別將刪除R1、R2和R3的部分gcvB基因與氯霉素抗性(cat)基因融合，擴增分為兩步：第1步以3409總DNA為模板，分別以(gcvBR1-F,gcvB-R)、(gcvBR2-F,gcvB-R)和(gcvBR3-F,gcvB-R)為引物進行擴增；以pKD3為模板，以(cat-F,cat-R)為引物進行擴增，取25 μL產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并膠回收。第2步分別取上述前3個反應的膠回收產物逐一與第4個混合(1∶1)作為模板，同時分別以gcvBR1-F和cat-R、gcvBR2-F和cat-R以及gcvBR3-F 和cat-R為引物進行擴增。上述所有反應體系均為：模板DNA 100～200 ng，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Pfu DNA Polymerase(5 U/μL)0.25 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.75 μL，10 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，10×Taq Buffer 6 μL，ddH2O補足80 μL。所有擴增反應均使用Touchdown PCR程序：95℃ 6 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 90s，循環5次；95℃ 10 s，53℃ 30 s，72℃ 90 s，循環20次；72℃ 8 min。取10 μL產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若無特異性條帶則將剩余產物用產物純化試劑盒回收并測量DNA濃度。

1.3.2無痕基因重組反應 第1步：按1∶100取3409過夜菌液于5 mL 液體LB中30℃ 170 r/min振蕩培養至D600 nm≈0.5，冰浴10 min后用10%甘油洗滌3次,取50 μL 10%甘油懸浮即為電轉化感受態細胞，將1 μL pKD46(100～200 mg/L)與50 μL 感受態細胞混合并轉入0.2 cm的Bio-Rad電極杯中，按Bio-Rad電轉儀預設參數(2.5 kV,5.8 ms)電擊轉化并迅速加入1 mL預冷的SOC復蘇液，將杯內液體轉入無菌空試管并于搖床30℃ 170 r/min條件下培養1 h，取100 μL涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板30℃過夜培養，次日挑單個陽性菌落過夜培養。第2步：取400 μL陽性菌過夜培養物及26μL 20%阿拉伯糖溶液于40 mL液體LB 30℃培養至D600 nm≈0.5，10%甘油洗滌5次并用100 μL 10%甘油懸浮制備電轉化感受態細胞，取上述純化的PCR產物100～200 ng與50 μL感受態細胞混合后電擊、37℃復蘇以及200 μL涂于氯霉素抗性平板37℃過夜培養，次日挑單個菌落以a-F和a-R為引物進行PCR及測序鑒定。電擊杯中PCR產物體積原則上不超過感受態細胞體積的10%，感受態細胞的制備全程于冰上操作且全程需注意無菌操作。

1.4 細菌總RNA的提取分別將3409、10241、STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔ R2和STM LT2gcvBΔR3菌株的過夜培養物按1∶100接種于5 mL液體LB中，除3409外其余均添加終質量濃度為25 mg/L的氯霉素，37℃ 170 r/min振蕩培養至D600 nm≈0.4，然后根據TRIzol說明書提取總RNA并測量濃度，產物保存于-80℃。

1.5 cDNA的制備分別取總RNA產物按反轉錄試劑盒說明書先進行去基因組處理然后反轉錄，cDNA置-20℃保存。

1.6 熒光定量PCR檢測基因轉錄水平通過普通PCR對GcvB調控基因的熒光定量PCR引物進行特異性檢測后，通過熒光相對定量法檢測各基因在不同基因型菌株中的轉錄水平，反應體系：2×AceQ SYBR qPCR Master Mix10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足20 μL。反應條件為95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環40次；熔解曲線分析：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個樣設3個重復,以16S rRNA cDNA作為內參基因，結果根據2-△△Ct法計算全部基因在不同基因型菌株中的相對表達水平[12]。

2 結果

2.1 基因敲除菌株的構建通過SOE-PCR結合Touchdown PCR制備同源重組目的片段并利用無痕基因重組系統構建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株。結果顯示，以a-F和a-R為引物通過PCR分別擴增包含gcvB在內的基因片段后，瓊脂糖凝膠電泳檢測出現與預期值一致的條帶(圖1)。測序分析結果對比3409gcvB基因序列(圖2)顯示，gcvB基因R1(圖3)、R2(圖4)和R3(圖5)已被成功敲除。結果表明，STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株已被成功構建。

M.DL2000 DNA Marker;A1.3409;A2.gcvBΔR1;A3.gcvBΔR2;A4.gcvBΔR3;A5.Blank control

GcvB.1～206 nt;R1.65～93 nt;R2.136～145 nt;R3.150～175 nt

圖3 STM LT2 gcvBΔR1株測序(A)和色譜(B)結果

圖4 STM LT2 gcvBΔR2株測序(A)和色譜(B)結果

圖5 STM LT2 gcvBΔR3株測序(A)和色譜(B)結果

2.2 熒光定量PCR檢測基因轉錄水平對GcvB調控基因的熒光定量PCR引物特異性檢測后進行熒光定量PCR檢測各基因在不同基因型菌株中的轉錄水平變化。結果顯示，STM LT2gcvBR1、gcvBR2或gcvBR3單敲除使fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因轉錄水平出現與gcvB單敲除時一樣大于2倍的下調變化，STM0276、exbD和sodA基因在gcvB、gcvBR1或gcvBR2單敲除時均出現轉錄水平下調大于2倍的變化，trpE和yifK基因則在gcvB或gcvBR3單敲除時出現轉錄水平上調大于2倍的變化(圖6)。以上結果表明，GcvB 調控fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因的表達與功能基序R1、R2和R3相關；調控STM0276、exbD和sodA基因表達與功能基序R1和R2相關；調控trpE和yifK基因表達與功能基序R3相關。

圖6 GcvB調控基因在不同基因型菌株中的轉錄表達水平

3 討論

Red同源重組技術常被應用于對細菌進行染色體基因定點修飾，該技術可精確地實現基因敲除、敲入及各種突變體的引入[13]。通常用抗性基因將原來的基因替換而達到敲除目的，進一步引入可表達FLP酶的質粒通過識別抗性基因兩側的FRT位點酶切抗性基因序列達到去除篩選基因目的，而這將留下一段30個核苷酸長的FRT序列[14]。為分析STM LT2 GcvB R1、R2和R3在所調控基因中是否發揮作用，本試驗在gcvB基因下游引入抗性基因，成功構建STM LT2gcvBΔR1、STM LT2gcvBΔR1 STM LT2gcvBΔR2和STM LT2gcvBΔR3菌株，測序結果表明各菌株gcvB基因除功能區被刪除外完整性未被改變，實現了基因的無痕敲除。

sRNAGcvB為反式編碼RNA，通常與靶標形成10～25個堿基對的sRNA-mRNA雙鏈結構，而GcvB與mRNA的結合區域目前已鑒定的有R1、R2和R3，3個功能基序通常以1個或以上與靶mRNA結合[15]。LALAOUNA等[9]認為，已鑒定的GcvB靶基因中，79%通過核糖體結合位點(ribosome binding site，RBS)與GcvB結合，15% 以CDS上游區域與GcvB作用，6%則以CDS下游區域作為GcvB靶位點。大多數情況GcvB通過干擾30S核糖體亞基結合來阻斷翻譯起始[16]。此外，GcvB也通過封閉翻譯增強子原件(富含C/A的序列)而有效抑制翻譯[7,17]。最近的研究證明，GcvB與mRNA配對并募集Rnase E來促進mRNA降解，這解釋了本研究中dppA、oppA、yifK和STM4351基因在轉錄水平發生不同變化的原因。這4個基因是已被驗證的GcvB直接調控靶標，均與沙門菌氨基酸攝取有關，gcvB基因的敲除均使它們在蛋白水平發生顯著上調變化[7,17]。而本研究中dppA和yifK基因在gcvB敲除后轉錄水平與蛋白水平均顯著上調，同樣的處理，oppA和STM4351基因轉錄水平卻未發生改變，而GcvB是轉錄后調控sRNA，分析認為這是GcvB不同的作用方式產生的結果，GcvB對dppA和yifK基因的作用機理或許為募集RNase E使其降解，對oppA和STM4351基因則通過封閉mRNA翻譯功能區阻礙翻譯的進行但不使mRNA降解，可能封閉30S核糖體亞基結合區域、富含C/A增強子區域或其它未被探明的序列，具體作用機理有待深入研究。

一直以來，對GcvB靶基因的挖掘主要局限于受其負調控的基因，而研究發現，沙門菌gcvB基因敲除后轉錄水平顯著下調的基因接近8%，當中相信還有許多未知正調控靶標及作用機理未被揭示[18]。現在已經記錄了一些sRNA正調控mRNA激活翻譯和穩定mRNA的例子，如sRNA SgrS與靶mRNA pldB堿基互補配對使RNase E識別序列被SgrS隔離從而避免mRNA被降解；同樣sRNA CsrA與大腸桿菌中的fhlDC mRNA的相互作用通過獨立于任何輔助sRNA的機制保護轉錄本不受RNase E的降解也是sRNA正向調控靶基因的例子[19]。本研究熒光定量PCR結果中fhuA、aphA、STM2714、STM0298、STM1827、STM0276、exbD和sodA基因分別與沙門菌的外膜蛋白受體/亞鐵蛋白、大腸菌素M和噬菌體(T1、T5及phi80)的轉運蛋白、非特異性酸性磷酸酶/B類磷酸轉移酶、Fels-2噬菌體蛋白、推定整合酶核心結構域蛋白、假定的雙鳥苷酸環化酶/磷酸二酯酶、推測的胞質蛋白、腸螯合素的攝取和超氧化物歧化酶相關，這8個基因在轉錄水平均下調，對GcvB相應功能區進行敲除后也出現與gcvB基因完全敲除時一樣的轉錄水平變化，預示GcvB對這些基因進行直接的正向調控，并推測GcvB R1、R2和R3對fhuA、aphA、STM2714、STM0298和STM1827基因發揮調控作用，R1和R2對 STM0276、exbD和sodA基因發揮調控作用，而這種調控機制可能是由于GcvB功能基序與RNase E競爭和mRNA的結合區域導致mRNA無法被核酸酶降解。