大腸桿菌致腦膜炎小鼠模型的構(gòu)建及腦脊液采集方法的改建

鐘昊然，王培莉，黃藍(lán)田，孟 霞，李建基，朱國(guó)強(qiáng)，崔璐瑩，董俊升，王 亨*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

大腸桿菌引發(fā)的腦膜炎是一種臨床上人和動(dòng)物都頗受關(guān)注的感染性疾病，主要由大腸桿菌隨血液進(jìn)入腦部而引發(fā)腦膜與腦實(shí)質(zhì)部位的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致相關(guān)損傷[1]。臨床上多聯(lián)合運(yùn)用腦脊液檢查、影像學(xué)、病原學(xué)檢查和血液學(xué)檢查等進(jìn)行鑒別診斷[2]。由于各類(lèi)型腦膜炎缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，不易鑒別診斷，故建立腦膜炎模型和收集樣本方法，對(duì)提高診出率具有重要意義[3]。本試驗(yàn)所用的大腸桿菌TW-XM菌株已被證實(shí)能引起雛鴨、雛雞的腦膜炎[4-5]。

腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)檢查是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病的重要檢查方法。腦脊液的性狀和成分變化可反映疾病的類(lèi)型和程度，所以當(dāng)CNS受損時(shí)，常進(jìn)行腦脊液的輔助檢查。但由于小鼠的腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，血管豐富，導(dǎo)致小鼠腦脊液采集過(guò)程復(fù)雜，失敗率較高[6]。本研究通過(guò)腹腔注射大腸桿菌構(gòu)建了大腸桿菌致小鼠腦膜炎模型，并改良了傳統(tǒng)小鼠腦脊液的采集方法，為腦脊液收集和進(jìn)行腦膜炎疾病診療提供相應(yīng)的思路和方法，同時(shí)也為腦膜炎致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性(institute of cancer research，ICR)小鼠20只，4周齡，體質(zhì)量20～30 g，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，每天12 h光照，12 h黑暗循環(huán)。飼養(yǎng)過(guò)程中給予全價(jià)飼料，自由飲水。

1.2 菌株和主要試劑與儀器大腸桿菌TW-XM菌株由揚(yáng)州大學(xué)朱國(guó)強(qiáng)教授饋贈(zèng)。眼科剪、眼科鑷購(gòu)自蘇州六六視覺(jué)科技有限公司；20 μL微量采血吸管購(gòu)自江蘇康健華醫(yī)療用品有限公司；LB培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Diff-Quik染色液購(gòu)自南京建成科技有限公司；異氟烷購(gòu)自山東科源制藥股份有限公司；ExTaq DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；Trans2000 DNA Marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸和基質(zhì)溶液購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Lecia公司。

1.3 動(dòng)物模型的構(gòu)建將保存的APEC TW-XM凍菌液用三區(qū)劃線法接種于LB平板培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中18～24 h，隨后挑取單菌落接種于3 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1∶100的比例重新轉(zhuǎn)接到新鮮的3 mL液體 LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，隨后取1 mL菌液5 000 r/min離心5 min后棄上清，用1 mL無(wú)菌生理鹽水重懸，將菌液的終濃度調(diào)整為1×108CFU/mL。將20只4周齡ICR小鼠隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組和大腸桿菌感染組，每組10只。大腸桿菌感染組：每只小鼠腹腔注射0.1 mL菌液(107CFU)；空白對(duì)照組：每只小鼠腹腔注射0.1 mL生理鹽水。

1.4 術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉手術(shù)所使用的眼科剪、眼科鑷、20 μL微量采血吸管均進(jìn)行高壓滅菌。小鼠術(shù)前12 h禁食禁水。手術(shù)采樣時(shí)使用2%的異氟烷混合氧氣進(jìn)行吸入麻醉，并監(jiān)護(hù)小鼠體征。

1.5 腦脊液的采集將小鼠頭部墊高，使小鼠頭部與軀干成120～135°角。對(duì)小鼠頸背部皮膚進(jìn)行剃毛消毒處理，用眼科剪沿頸背部皮膚正中線作一縱行切口，長(zhǎng)度約為1 cm，鈍性分離頸背部肌肉，暴露頭后小直肌，將改造的微量穿刺管(圖1)，刺入枕骨大孔直至硬脊膜(圖2)，當(dāng)有明顯的落空感時(shí)，停止刺入，可見(jiàn)到清亮的腦脊液沿微量吸管緩慢上升。當(dāng)管內(nèi)腦脊液的液面高度停止上升時(shí)，將吸管退出，可取到3～5 μL腦脊液。

A.處理前；B.處理后

A.經(jīng)肌肉穿刺延髓池；B.微量穿刺管采集到的腦脊液

1.6 腦脊液染色鏡檢將腦脊液涂片，固定，并進(jìn)行Diff-Quik染色，鏡檢。

1.7 細(xì)菌的分離及純化將采集的感染組小鼠腦脊液涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落，轉(zhuǎn)培進(jìn)行純培養(yǎng)，后涂片，進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.8 分離菌的鑒定根據(jù)GenBank中APEC TW-XM菌株(NO.KF678349.1)已知的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物5′-TCATGGGTGGAAAATGCCGA-3′、下游引物3′-GGTGTCCTGGCCCTT-TCAAA-5′，引物由南京擎科生物技術(shù)公司合成。以超純水作為陰性對(duì)照，攻毒所用的TW-XM菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，用PCR方法鑒定腦脊液中分離純化的細(xì)菌。PCR反應(yīng)體系為ExTaq DNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，細(xì)菌DNA模板1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至25.0 μL。PCR程序?yàn)?4℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳在0.5×TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳分析。若出現(xiàn)200 bp的特異性擴(kuò)增條帶則為陽(yáng)性，否則為陰性。鑒定正確后由南京擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。

1.9 腦組織病理學(xué)檢查采用脫頸法安樂(lè)小鼠，收集大腦組織。將采集的樣品，置于10%中性甲醛溶液中，固定48 h后取出，流水沖洗12 h；進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明及浸蠟后包埋于石蠟中；常規(guī)切片，采用蘇木精和伊紅染色，封片后鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臨床癥狀檢查結(jié)果感染12 h后，感染組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、倦怠懶動(dòng)、被毛粗亂、眼分泌物增多、拉稀并伴有癲癇、角弓反張等神經(jīng)癥狀(圖3)。空白對(duì)照組小鼠則精神狀況良好、被毛平滑有光澤、運(yùn)動(dòng)自如。

圖3 小鼠臨床癥狀觀察

2.2 小鼠腦脊液性狀及染色鏡檢感染12 h后，采集各組小鼠腦脊液。Diff-Quik染色后于顯微鏡下觀察，可見(jiàn)感染組小鼠腦脊液中含有桿狀菌落，而空白對(duì)照組小鼠腦脊液中未見(jiàn)桿狀菌落(圖4)。

A.空白對(duì)照組；B.感染組;紅色箭頭.桿狀菌落

2.3 細(xì)菌形態(tài)觀察及革蘭染色結(jié)果將采集的感染組小鼠腦脊液涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃ 培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)菌落呈圓形，微紅色，邊緣整齊，菌落表面光滑，濕潤(rùn)(圖5A)。革蘭染色觀察結(jié)果顯示細(xì)菌為革蘭陰性菌，兩端鈍圓，短桿棒狀(圖5B)。

A.細(xì)菌培養(yǎng)形態(tài)；B.革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.4 組織病理學(xué)檢查腦膜和大腦皮層的HE染色切片結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠腦膜正常且連續(xù)，與大腦皮層貼合緊密(圖6A)。感染組小鼠腦膜增厚、水腫、出血，腦膜及腦實(shí)質(zhì)血管擴(kuò)張充血，大腦皮層有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，大腦皮層壞死崩解(圖6B)。

A.空白對(duì)照組；B.感染組

2.5 特異性片段擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)TW-XM菌株的序列設(shè)計(jì)特異性引物，用PCR方法對(duì)腦脊液分離菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照和所有分離菌均能擴(kuò)增出200 bp的條帶，陰性對(duì)照未能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖7)，且測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確，說(shuō)明分離菌與TW-XM的分子特性相符。

M.Trans2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性對(duì)照TW-XM；3～6.腦脊液分離菌

3 討論

細(xì)菌性腦膜炎是世界十大威脅生命的感染性疾病之一，其病原菌存在地區(qū)差異性[7]。發(fā)達(dá)國(guó)家的腦膜炎致病菌主要為腦膜炎奈瑟菌和肺炎鏈球菌；而發(fā)展中國(guó)家的腦膜炎致病菌則更加多樣，主要為單增李斯特菌和大腸桿菌[8]。但由于各類(lèi)型腦膜炎的臨床癥狀不具有特異性，診斷難度較大。上述各種細(xì)菌能破壞或者穿越血-腦屏障(blood-brain barrier,BBB)，進(jìn)而對(duì)腦部進(jìn)行侵襲和破壞，而大部分藥物無(wú)法穿越BBB到達(dá)腦部，使治療難度進(jìn)一步增加，導(dǎo)致病死率高且預(yù)后不良[8-9]。研究表明發(fā)展中國(guó)家的新生兒與老年患者的病死率更高[7,10]。

細(xì)菌性腦膜炎對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害同樣巨大，其典型癥狀為家畜頭頸伸直、發(fā)熱、癲癇、肢體運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)癥狀和腦缺血、腦積液和顱內(nèi)壓增高等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，若產(chǎn)生過(guò)度炎癥反應(yīng)則預(yù)后不良[11]。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli,APEC)TW-XM菌株已被證實(shí)能引起雛鴨和雛雞的腦膜炎，且TW-XM與新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli，NMEC)的基因型高度同源，故對(duì)該菌株的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[4-5,12]。

目前，已有研究報(bào)道了多種不同方法建立的細(xì)菌性腦膜炎動(dòng)物模型。董燕等[13]通過(guò)小腦延髓池注射肺炎鏈球菌菌液成功構(gòu)建大鼠腦膜炎模型，周程遠(yuǎn)等[14]利用相同的攻菌方法成功構(gòu)建犬大腸桿菌型腦膜炎模型，而小鼠腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，故該方法不適用于小鼠腦膜炎模型的構(gòu)建。李慧等[15]采用腹腔注射糞腸球菌菌液成功構(gòu)建了小鼠腦膜炎模型，證明通過(guò)腹腔注射細(xì)菌菌液構(gòu)建小鼠腦膜炎模型存在可行性。本方法中，在腹腔注射大腸桿菌TW-XM菌株12 h后，感染組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、倦怠懶動(dòng)、被毛粗亂、眼分泌物增多、拉稀并伴有癲癇、角弓反張等神經(jīng)癥狀；采集的腦脊液經(jīng)Diff-Quik染色后可見(jiàn)感染組小鼠腦脊液中含有桿狀菌落，說(shuō)明大腸桿菌已穿越BBB進(jìn)入腦部；腦部組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)感染組小鼠腦膜增厚、水腫、出血，腦膜及腦實(shí)質(zhì)血管擴(kuò)張充血，大腦皮層有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，大腦皮層壞死崩解，說(shuō)明腦部已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重的病理變化。同時(shí)，利用革蘭染色和分子生物學(xué)手段對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為T(mén)W-XM菌株[16-17]。以上試驗(yàn)均可證實(shí)大腸桿菌型腦膜炎小鼠模型構(gòu)建成功。

腦脊液成分變化可以間接反應(yīng)腦部的生理或病理情況，因此腦脊液的采集分析是CNS疾病診斷常用的技術(shù)。各類(lèi)型腦膜炎的腦脊液檢查結(jié)果各有不同，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌性腦膜炎時(shí)，腦脊液中嗜中性粒細(xì)胞會(huì)升高；當(dāng)發(fā)生病毒性腦膜炎時(shí)，腦脊液中淋巴細(xì)胞會(huì)增多。通過(guò)觀察腦脊液中的異常細(xì)胞可以初步診斷出感染類(lèi)型[3]。腦脊液其他常規(guī)檢查則包括透明度、顏色以及潘氏試驗(yàn)等，上述試驗(yàn)均可為臨床早期的治療與用藥提供參考[18-19]。

由于腦脊液采集方法、材料和技術(shù)的限制，腦脊液采集常常成為動(dòng)物試驗(yàn)中的重要技術(shù)之一，尤其在體型小的動(dòng)物收集更加困難。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的腦脊液采集方法主要有經(jīng)皮膚直接穿刺延髓池抽取法、經(jīng)肌肉穿刺硬脊膜抽取法和暴露硬脊膜直接抽取法[6,20-21]。王偉等[21]利用自制的負(fù)壓吸引裝置，通過(guò)皮膚直接穿刺延髓池采集SD大鼠腦脊液，成功率約為75%。朱奕昕等[22]利用腦立體定位儀固定SD大鼠腦部，并用微量進(jìn)樣器分別采用上述3種方法采集大鼠腦脊液，結(jié)果顯示經(jīng)肌肉穿刺硬脊膜抽取法的成功率最高。小鼠的腦室及蛛網(wǎng)膜下腔相較于大鼠則更為狹小，腦脊液采集難度更大，經(jīng)皮膚直接穿刺延髓池抽取法和暴露硬脊膜直接抽取法的失敗率較高。故本研究在以往報(bào)道的基礎(chǔ)上，對(duì)經(jīng)肌肉穿刺硬脊膜抽取法進(jìn)行以下幾點(diǎn)調(diào)整：(1)通過(guò)自制微量穿刺管，降低材料獲取難度及成本；(2)將傳統(tǒng)的藥物腹腔注射麻醉改為異氟烷吸入麻醉，可根據(jù)需要調(diào)整麻醉深度，并易于監(jiān)控小鼠體征。吸入麻醉不僅能降低小鼠在麻醉過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)，也能降低因采樣操作不當(dāng)而導(dǎo)致的小鼠死亡率。本方法中的穿刺位置更容易掌握，可減少操作誤差，并且能在一定程度上減少因出血而導(dǎo)致的腦脊液污染。

綜上所述，通過(guò)腹腔注射大腸桿菌TW-XM菌液可成功構(gòu)建小鼠腦膜炎模型，經(jīng)過(guò)改進(jìn)的經(jīng)肌肉穿刺延髓池抽取腦脊液的方法具有簡(jiǎn)單、快捷、高效等優(yōu)點(diǎn)，是一種較好的小鼠腦脊液采集方法，并且該方法能成功運(yùn)用到大腸桿菌致腦膜炎小鼠模型中。該動(dòng)物模型的構(gòu)建與腦脊液方法的改良可為小鼠腦脊液的實(shí)驗(yàn)室研究提供參考，為腦膜炎致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。