羊源D型產氣莢膜梭菌分離鑒定及耐藥性與致病性分析

趙學亮，王晨驍，王 斌，馮 航，葉 超，黨如意，王 娟，楊增岐

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)是廣泛存在于食物、土壤、水源、糞便及人畜消化道的一種條件性致病菌[1]。該菌由英國人WELCHII于1982年在腐敗尸體中分離獲得，從而命名為魏氏梭菌。它可以分解機體內的糖產生氣體，還可以形成莢膜，故又稱為產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)[2]。產氣莢膜梭菌是一種革蘭陽性厭氧菌，屬于桿菌科梭菌屬，可導致畜禽氣性壞疽、壞死性腸炎、猝死癥、腸毒血癥、羔羊痢疾以及人的食物中毒等多種疾病[3-6]。該菌致病作用主要由于它所產生的毒素所導致，目前已經發現的毒素有20種，主要致死毒素為α、β、ε和ι，根據產生這4種毒素的能力將該菌分為A(產α毒素)、B(產α、β和ε毒素)、C(產α和β毒素)、D(產α和ε毒素)和E(產α和ι毒素)5個型[7]。

近20年來，產氣莢膜梭菌病嚴重制約養羊業的發展，給畜牧業帶來巨大經濟損失的同時威脅人類健康。CHUKWU等[8]從食品中檢測出A型和D型產氣莢膜梭菌，據報道該菌已嚴重影響尼日利亞食品公共衛生。在我國，關于A型產氣莢膜梭菌的分離鑒定報道較多[9-10]，有關D型產氣莢膜梭菌臨床分離株的報道相對較少。孟莉等[11]于2018年在急性死亡的奶山羊小腸中分離到D型產氣莢膜梭菌，分離株不僅對卡那霉素、慶大霉素和鏈霉素等耐藥，同時具有較強的毒力。D型產氣莢膜梭菌以其高致病性的α和ε毒素誘發羊腸毒血癥，導致急性死亡。2020年9月，內蒙古烏審旗膘情較好的放牧綿羊陸續出現臥地痙攣、突然死亡的情況，剖檢主要表現為腸毒血癥、壞死性腸炎和小腸黏膜嚴重出血。本試驗從內蒙古烏審旗猝死綿羊小腸中分離出1株致病菌，經分離培養、16S rRNA擴增測序、毒素基因PCR鑒定、生化鑒定及藥敏試驗，確定為D型產氣莢膜梭菌。本試驗旨在對指導羊源D型產氣莢膜梭菌合理用藥、減少多重耐藥菌株的出現提供依據，為分離株耐藥基因及耐藥機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集內蒙古烏審旗某放牧羊群中突發死亡羊只，解剖后可見心包積液，心臟及肺臟有出血點，回腸充血、出血。無菌采集病死羊的肝臟、肺臟、腸道及內容物立即放入冰箱冷凍保存，無菌條件下帶回實驗室分離細菌。

1.2 主要試劑及儀器營養瓊脂培養基、厭氧肉肝湯培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；生化試劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Ladder購自北京Genstar生物科技有限公司；引物由西安擎科生物技術有限公司合成。離心機、PCR儀及移液槍購自Eppendorf公司；超凈工作臺購自濟南鑫貝西生物技術有限公司等。

1.3 細菌分離及培養將無菌采集的樣品加入到厭氧肉干湯培養基中，37℃厭氧箱中培養18～24 h后劃線接種TSC平板，然后選擇黑色菌落接種鮮血瓊脂平板，厭氧培養16～20 h后，挑取帶溶血環的單菌落進行革蘭染色和顯微鏡檢查。

1.4 分離株16S rRNA擴增及測序按照天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明進行分離株DNA提取，以16S rRNA通用引物(表1)進行PCR擴增，反應體系(25 μL)：2×Easy Taq PCR Super mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O補齊至25 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

16S rRNA基因的PCR擴增產物送至西安擎科生物技術有限公司測序，將測序結果在NCBI中進行Blast比對，選取同源性相近的序列，應用MEGA 7.0軟件對選取的序列進行同源性分析及進化樹構建。

1.5 主要毒素基因PCR鑒定以1.4中提取的基因組DNA為模板，利用參考文獻[12]中的引物(表1)，進行α毒素(CPA)、β毒素(CPB)、ε毒素(ETX)、ι毒素(ITX)擴增，預期片段分別為：325，236，585，445 bp。同時參考文獻[13]建立的方法進行多重PCR擴增試驗。PCR反應產物經膠回收試劑盒純化后送往擎科生物技術有限公司進行測序，將所得序列與GenBank梭菌毒素基因序列進行比對。

表1 PCR鑒定引物序列信息

1.6 生化鑒定及藥敏檢測取厭氧肉干湯培養基中的分離株純培養物，利用杜氏小管進行常規生化試驗。取純培養物，制備0.5麥氏濁度菌懸液，吸取100 μL均勻涂布于MH瓊脂培養基上，放置5片實驗室自制的藥敏紙片，倒置在37℃厭氧培養箱中24 h后測量抑菌圈直徑，按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)和M100抗微生物藥物敏感性試驗執行標準(2020中文版)進行判定。

1.7 動物致病性試驗將9只3周齡健康昆明小鼠隨機分為3組，每組3只。取分離菌的純培養物(未用0.22 μm濾器過濾)，第1，2組分別腹腔注射0.2，0.3 mL/只(2×108～3×108CFU/mL)，第3組作為陰性對照，注射生理鹽水0.3 mL/只，接種后分開飼養，每小時觀察小鼠情況。剖檢小鼠，觀察組織器官病理變化，采集肝臟、肺臟、小腸等組織，分離細菌。

2 結果

2.1 分離株形態及培養特征分離株為厭氧菌，在TSC平板上37℃培養24 h后形成黑色菌落，在血瓊脂平板上形成圓形、灰白色、表面光滑、邊緣整齊的菌落，并有明顯的溶血環。分離株染色特征為革蘭陽性菌，菌體呈兩端鈍圓的粗大短桿狀、無鞭毛、短鏈較少，單個或成雙排列。根據細菌形態及培養特征初步表明分離株可能是產氣莢膜梭菌(圖1)。

圖1 分離株革蘭染色

2.2 16S rRNA基因PCR擴增及同源性分析在血瓊脂培養基上獲得純培養物，選取單克隆菌落，提取細菌DNA，經16S rDNA通用引擴增后獲得與1 386 bp 相符的條帶(圖2)，測序后經Blast比對分析確定為產氣莢膜梭菌。將分離菌株16S rRNA序列命名為“NMG-1”，測序結果與其他15株(14株梭菌和1株大腸桿菌)同源性較近的菌株16S rRNA參考序列進行比對，系統進化分析顯示NMG-1株與GenBank中武漢分離株MT613499.1同源性99.49%，不同分型和來源的產氣莢膜梭菌16S rRNA序列同源較高，但與不同種間差異較大，與大腸桿菌AF289502.1遺傳距離最遠，同源性僅為80.21%(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.分離株；3.陰性對照

圖3 產氣莢膜梭菌NMG-1系統進化樹

2.3 NMG-1株毒素基因PCR擴增提取細菌基因組DNA，對產氣莢膜梭菌α、β、ε和ι 4種毒素進行PCR擴增，可見325 bp的α毒素、584 bp的ε毒素特異性條帶，未見β和ι毒素條帶(圖4)。同時用多重PCR對4種毒素進行擴增，結果出現與預期相符的特異性條帶。將PCR產物測序，序列結果與GenBank中的α和ε毒素基因同源性為100%，由于D型產氣莢膜梭菌可產生α和ε毒素，因此可確定分離菌為D型產氣莢膜。

M.DL700 DNA Marker；1.α毒素；2.β毒素；3.ε毒素；4.ι毒素

2.4 NMG-1株生化特性將分離的NMG-1菌株按《伯杰細菌鑒定手冊》標準進行乳糖、葡萄糖、麥芽糖、三糖鐵、硫化氫、蛋白胨水、尿素、枸櫞酸和甘露醇生化鑒定，根據菌株生化試驗結果(表2)，判斷為產氣莢膜梭菌。

表2 NMG-1株生化鑒定結果

2.5 NMG-1株藥敏試驗結果分離菌對阿莫西林、復方阿莫西林、氨芐西林、氨芐青霉素、頭孢噻呋鈉、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、替米考星、磺胺異惡唑等完全耐藥，對泰萬菌素、泰樂菌素、恩諾沙星表現為中敏，對多西環素、金霉素、土霉素、泰妙菌素、氟苯尼考表現為極敏。

2.6 NMG-1株小鼠致病性試驗小鼠注射0.2 mL菌液后8 h全部死亡，小鼠注射0.3 mL菌液3 h內全部死亡，而注射生理鹽水的對照組小鼠無異常。將試驗組死亡小鼠剖檢后，可見腸黏膜嚴重充血、淤血和水腫，接種環無菌穿刺病死小鼠肝臟，接種血瓊脂平板，厭氧箱37℃培養24 h，經革蘭染色及鑒定，得到與NMG-1相同的菌株。結果表明，NMG-1分離株對小鼠具有較強的致病性。

3 討論

內蒙古烏審旗擁有豐富的優質天然草牧場，是鄂爾多斯細毛羊(210萬只)的主產區。2020年9月烏審旗100多只放牧綿羊陸續死亡，多數為四肢抽搐、突然死亡，有的則無臨床癥狀、悄然死亡。本試驗從猝死羊小腸中分離出致病菌，通過細菌分離培養、革蘭染色、生化鑒定、16S rRNA序列鑒定，確定為產氣莢膜梭菌。產氣莢膜梭菌病是一種重要的人獸共患病，其釋放的致病毒素可導致動物猝死，也可導致人食物中毒。通過毒素基因PCR及多重PCR確定為D型產氣莢膜梭菌，多重PCR是在普通PCR基礎上加入多對引物，在一個PCR管中同時檢測多種毒素，從而進行產氣莢膜梭菌分型[14]。

D型產氣莢膜梭菌引起羊腸毒血癥，剖檢病死動物時又因腎組織軟化，故又稱為“軟腎病”[15]。動物采食被D型產氣莢膜梭菌污染的飼料或飲水，細菌進入小腸大量繁殖并產生毒素導致迅速死亡[16-17]，往往來不及使用藥物，因此對于該病的預防，免疫接種尤為重要[18]。早在20世紀80年代，我國就研制出產氣莢膜梭菌的單價苗和多價滅活苗，對該病的預防發揮重要作用。在本次發病過程中，羊群已用“B型引起的羊黑疫、C型引起的羊猝狙、D型引起的羊腸毒血癥、腐敗梭菌引起的羊快疫”三聯四防菌苗進行免疫接種，但仍陸續出現發病現象，因此開發一種安全性高、穩定性好，能夠預防多種產氣莢膜梭菌病的亞單位疫苗尤為重要。但是羊在發病到死亡期間曾長時間自由采食青草，由于秋季放牧草原富含蛋白質，被動物采食后通過胰蛋白酶轉化成ε原毒素，從而繼發羊腸毒血癥。因此懷疑此次疫情的發生與長時間采食高蛋白的青草果實有必然聯系。

近年來，內蒙古烏審旗羊梭菌病呈散發形勢流行，對于該病的治療能用抗生素及化學合成藥[19]，但是由于抗菌藥物在動物養殖過程中廣泛使用甚至濫用加劇了產氣莢膜梭菌耐藥性的出現，并可通過“動物—食品/環境—人體”傳播，危害食品安全和人類健康[20]。藥敏試驗表明，此菌株對阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢噻呋鈉、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、替米考星、磺胺異惡唑等表現100%耐藥，說明這些抗生素在該地區羊群中廣泛使用，從而導致了耐藥性。由于臨床上普遍用抗生素治療產氣莢膜梭菌，致使動物用藥陷入“耐藥菌↑→用藥量/種類↑↑→耐藥菌↑↑↑”的惡性循環，所以在選擇用藥時必須進行藥敏試驗，減少多重耐藥菌株的出現。另外，司南等[21]通過對遷徙候鳥產氣莢膜梭菌的耐藥性情況進行分析，發現分離菌株對黏菌素、桿菌肽、克林霉素和紅霉素的耐藥率在40%以上，表明候鳥遷徙是耐藥性傳播的重要方式，同時候鳥對部分抗生素的高耐藥性也值得關注。FAYEZ等[22]通過對駱駝源產氣莢膜梭菌進行藥敏分析，同樣表明該菌耐藥現象嚴重且為多重耐藥。本試驗小鼠致病性試驗中，所有試驗組小鼠8 h內全部死亡，表明該菌株具有很強的致病能力。因此，深入研究產氣莢膜梭菌耐藥性與致病性之間的關系，建立優化梭菌病原體的檢測方法，研發制備行之有效的疫苗和藥物，將對本病防治起到重要作用。