河北省部分地區犢牛腹瀉大腸桿菌優勢血清型篩選及兼性菌毛株的致病性

關一凡，李 妍，高亞桃，常麗云，楊曉彤，賈仲昕，秦建華，趙月蘭

(河北農業大學 動物醫學院，河北 保定 071000)

犢牛大腸桿菌病(calf colibacillosis)又被稱為犢牛白痢，是由某些致病性的大腸桿菌引起犢牛腹瀉、脫水、酸中毒及死亡的一種全球性急性傳染病。此病呈散發或地方性流行，一年四季均可發生，尤其冬春季節常見。出生1月齡內的牛易感染本病，主要的病理變化大都集中在消化道，有的在臍部或生殖道。大腸桿菌也是一種條件致病菌[1]，一般情況下，大腸桿菌存在于人或動物的腸道，與其他有益菌共存，維持腸道菌群平衡狀態。在某些因素影響下，導致腸道內致病性大腸桿菌增多，由于犢牛抵抗力低下，難以抵御感染，最終造成大腸桿菌病的發生。大腸桿菌抗原結構復雜多樣，至今為止，被發現的O抗原約有180種，K抗原有103種，H抗原有60多種，F抗原有17種[2]，而且抗原的種類也在不斷變化，常會導致新抗原的產生。據相關學者報道，大腸桿菌可以通過菌毛黏附定居在腸道黏膜的上皮細胞，使腸道黏膜受損，導致功能異常、引發腹瀉[3-4]。

近些年來，在我國由大腸桿菌引起犢牛腹瀉的發病率高達90%，病死率為40%～50%[5]，給我國的養殖業造成了巨大的經濟損失。本試驗從河北省4個地區奶牛場采集犢牛腹瀉糞便，通過對病原的分離鑒定、篩選其優勢血清型，并鑒定出菌毛類型，利用小鼠致病性試驗分析其毒力，以期為控制犢牛大腸桿菌病的發生提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物21日齡昆明小鼠，購自斯貝福(北京)生物有限公司。

1.2 主要試劑DL1000 DNA Marker、Taq酶、10×Buffer、dNTP等購自大連寶生物工程公司。麥康凱固體培養基、LB液體培養基、Minca培養基、革蘭染色液等均購自當地生物公司和化學試劑有限公司。大腸桿菌O因子定型血清診斷液(O101、O9、O78、O102、O2、O38、O104、O137、O64、O15、O141)購自中國獸醫藥品監察所；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為世紀科技(北京)有限公司；細菌生化反應管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器PCR擴增儀購自Biometra；電泳儀購自北京六一儀器廠；化學發光成像系統購自美國Proteinsimple；YS100光學雙目顯微鏡購自Nikon公司。

1.4 引物的合成參考GenBank上公布的EscherichiacoliF41(M21788.1)和K99(M35282.1)菌毛基因序列設計引物：F41F:5′-GCATCAGCGGCAGTATCT-3′，F41R:5′-GTCCCTAGCTCAGTATTATCA CCT-3′；K99F:5′-TATTATCTTAGGTGGTATGG-3′，K99R：5′-GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC-3′；參考文獻[6]設計牛大腸桿菌16S rRNA基因引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以上引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 樣品的采集從河北省肅寧、定州、望都、曲陽4個地區的奶牛場采集1月齡左右腹瀉犢牛的新鮮糞便56份，置于4℃保存，24 h內進行大腸桿菌的分離。

1.6 細菌的分離培養與鑒定將保存的犢牛腹瀉糞便樣品經生理鹽水稀釋，均勻涂布于麥康凱培養基表面，37℃培養18 h；挑取單菌落接種于5 mL的LB液體培養基中，37℃、220 r/min培養36 h;按1∶100 的比例將菌液接種于LB液體培養基，37℃ 220 r/min培養36 h；再按同樣的將培養后菌液按1∶100 的比例接種于Minca培養基，37℃培養36 h[7]。取培養的菌液經革蘭染色，置于1 000倍油鏡下鏡檢，觀察并記錄菌體形態、大小和染色特性。

經麥康凱鑒別培養基鑒定后的陽性樣品，挑取其單菌落，置于LB液體培養基中培養，接種針蘸取菌液接種于硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側金盞花醇、木糖生化反應管，35℃培養24～48 h，并進行吲哚試驗和甲基紅試驗，觀察反應管的現象，鑒定其生化特性。

1.7 分離菌的PCR鑒定及測序鑒定

1.7.1大腸桿菌基因組DNA的提取 將1.6中分離培養菌液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書操作，提取細菌基因組DNA，-20℃保存。

1.7.2大腸桿菌16S rRNA基因PCR擴增與測序鑒定 利用牛大腸桿菌16S rRNA引物對提取的細菌基因組DNA進行PCR擴增,預期目的條帶長度約1 500 bp。PCR反應體系為：細菌基因組DNA作為：模板1 μL，上、下引物各1 μL，Taq酶0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，滅菌水補足至50 μL。PCR反應條件為：預變性98℃ 3 min；變性98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min,共循環30次；再延伸72℃ 5 min。PCR產物置于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳試驗，純化回收后，送去生工生物工程有限公司進行測序。

1.8 大腸桿菌優勢血清型篩選

1.8.1大腸桿菌O抗原的制備 將分離的大腸桿菌株劃線接種于麥康凱培養基，37℃培養16 h，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，37℃、220 r/min培養12 h；培養好的菌液裝入離心管，121℃高壓2 h[8]。取高壓后的大腸桿菌抗原于離心管中，10 000 r/min 離心2 min，棄上清。使用0.5%石炭酸生理鹽水重懸沉淀，此時液體呈渾濁黏稠狀，4℃保存[9～11]。

1.8.2大腸桿菌O抗原血清型的鑒定 結合國內學者報道的我國部分地區奶牛場流行的致犢牛腹瀉大腸桿菌優勢血清型類型，選出11種大腸桿菌 O因子定型血清(O101、O9、O78、O102、O2、O38、O104、O137、O64、O15、O141)分別與制備的大腸桿菌抗原進行玻板凝集試驗，鑒定大腸桿菌O抗原的血清型。取大腸桿菌O因子定型血清50 μL滴加到載玻片上，再吸取大腸桿菌抗原 50 μL于玻片上，混勻，呈硬幣厚的薄膜狀，靜置3 min。并用生理鹽水做空白對照[12-14]。觀察記錄是否出現凝集現象，判定大腸桿菌的血清型。

1.9 大腸桿菌菌毛的鑒定對分離鑒定的大腸桿菌進行DNA提取，使用合成的菌毛引物進行PCR擴增。菌毛F41的PCR反應體系為：模板1 μL，上、下引物各1 μL；Taq酶0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，滅菌水補足至25 μL。PCR反應條件為：預變性98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s,共30個循環；72℃ 延伸5 min。菌毛K99的PCR反應體系與菌毛F41的PCR反應體系一致；PCR反應條件為：預變性98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30個循環；72℃ 延伸5 min。使用膠回收試劑盒按說明書操作對出現的目的條帶進行回收，純化后的產物進行測序鑒定。

1.10 大腸桿菌致病性試驗將分離鑒定的兼性菌毛株O101：F41：K99菌株擴大培養，將菌株菌液稀釋成5個濃度，分別是1.5×106，1.5×107，1.5×108，1.5×109，1.5×1010CFU/mL，將21日齡的昆明小鼠分成6組，每組5只，1～5組為試驗組，按照5種菌液濃度從高到低分別腹腔注射500 μL菌液；6組為空白對照組，腹腔注射生理鹽水500 μL[15]。觀察并記錄小鼠5 d內的發病和病死情況，解剖小鼠并對有病變的臟器進行細菌分離鑒定。

將分離鑒定的單菌毛菌株O101：F41和O101：K99菌株擴大培養，將菌株菌液稀釋成4個濃度，分別是1.5×109，1.5×1010，1.5×1011，8×1011CFU/mL。將21日齡的昆明小鼠分成5組，每組5只，1～4組為試驗組，按照4種菌液濃度從高到低分別腹腔注射500 μL；5組為空白對照組，腹腔注射生理鹽水500 μL。觀察并記錄小鼠5 d內的發病和病死情況，解剖小鼠并對有病變的臟器進行細菌分離鑒定。

2 結果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結果從河北省4個地區的奶牛場采集犢牛腹瀉的新鮮糞便，經麥康凱培養基鑒別培養，56份犢牛腹瀉糞便樣品有48份培養基中培養出單菌落，將其編號為DC1-48，有8份未培養出單菌落。肅寧地區和定州地區奶牛場分別采集的12份犢牛糞便樣品中均培養出單菌落；首農地區奶牛場18份樣品中13份培養出單菌落，5份未培養出單菌落；曲陽地區奶牛場14份樣品中11份培養出單菌落，3份未培養出單菌落。可見單個菌落為玫紅色、橢圓形，表面呈光滑、濕潤的生長狀態(圖1A)。挑取單菌落經革蘭染色后，在1 000倍油鏡下觀察，可見分離菌為革蘭陰性短桿菌(圖1B)，符合大腸桿菌的形態特征和生長特性。

A.菌落特征；B.菌體特征

將麥康凱培養基鑒別培養后的48份陽性樣品培養成菌液后，接種于11種生化反應管，結果可見48份菌液均不產生硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶，不能利用枸櫞酸鹽，在半固體瓊脂上不能擴散生長；能使賴氨酸脫羧，但不能使鳥氨酸脫羧；能發酵山梨糖和木糖，但不能發酵側金盞花醇和棉子糖；甲基紅試驗和吲哚試驗均為陽性結果。以上反應結果均屬于大腸桿菌的生化特性，說明48份菌液均為大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌16S rRNA基因PCR鑒定結果對分離培養的48份大腸桿菌菌液提取核酸后，經16S rRNA基因PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現特異性目的條帶，約為1 500 bp(圖2)，符合預期結果。

M.DL2000 DNA Marker;1～48.樣品16S rRNA基因PCR擴增產物

2.3 大腸桿菌16S rRNA基因序列分析結果經大腸桿菌16S rRNA基因引物PCR擴增后的產物進行測序后，將測序結果與NCBI上公布的大腸桿菌16S rRNA基因序列進行BLAST比對，結果48株分離菌與已發表的大腸桿菌序列同源性均在97%～99.7%范圍內，與大腸桿菌MH671460.1同源性最高(圖3)，說明分離得到的菌株均為大腸桿菌。

1～18.GenBank上發布的大腸桿菌16S rRNA基因序列；19～24.部分分離菌的基因序列

2.4 大腸桿菌優勢血清型篩選結果河北省4個地區奶牛場48份犢牛腹瀉大腸桿菌抗原與大腸桿菌O因子定型血清經玻板凝集試驗鑒定，有36份菌株鑒定出O抗原血清型，12份未鑒定出血清型。其中，肅寧地區12株大腸桿菌中有6份與O101出現凝集，3株與O102出現凝集，1份與O78出現凝集；定州地區12株大腸桿菌中8株與O101出現凝集，1株與O104出現凝集；望都地區13株大腸桿菌，6株與O101出現凝集，3株與O78出現凝集；曲陽地區11株大腸桿菌中4株與O101出現凝集，2株與O102出現凝集，O104和O15各有1株與其出現凝集(表1)。綜合來看，48份大腸桿菌抗原有24份與大腸桿菌O101出現凝集反應，占出現凝集反應總數的2/3,表明河北省部分地區犢牛腹瀉大腸桿菌的優勢血清型主要為O101。

表1 犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型鑒定結果

2.5 大腸桿菌菌毛鑒定結果利用大腸桿菌菌毛K99和F41基因引物對血清型為O101的24株大腸桿菌進行PCR擴增，鑒定菌毛類型(圖4A)，有6株大腸桿菌擴增出特異性目的條帶，大小約為314 bp，與菌毛基因K99的預期條帶大小一致；有7株大腸桿菌擴增出特異性目的條帶，約為380 bp，與菌毛基因F41的預期條帶大小一致(圖4B)，其中有1株分離菌可以擴增出菌毛F41基因和菌毛K99基因。

M.DL1000 DNA Marker;A.菌毛K99鑒定結果；A1～A21.菌毛K99基因;B.菌毛F41鑒定結果；B1～B19.菌毛F41基因

擴增的目的基因序列與大腸桿菌K99菌毛基因序列的同源性在94.1%～100%之間，與大腸桿菌K99菌毛MH916617.1序列同源性最高(圖5)，說明6株大腸桿菌攜帶的菌毛均為K99。其中兼性菌毛株(O101：F41：K99)擴增的目的基因序列與FJ864678.1、JX987524.1、KR870316.1、KX461930.1、MF955843.1、MH916617.1序列同源性最高，均為99.6%。

1～8.GenBank上公布的大腸桿菌K99菌毛基因序列；9.為兼性菌毛株的K99菌毛基因擴增序列；10,11.部分樣品的大腸桿菌K99菌毛基因擴增序列

擴增的目的基因序列與大腸桿菌F41菌毛基因序列的同源性在93.9%～100%之間，與大腸桿菌F41菌毛MF955845.1序列同源性最高(圖6)，說明7株大腸桿菌攜帶的菌毛均為F41。其中兼性菌毛株(O101：F41：K99)擴增的目的基因與MF955845.1、M21788.1序列同源性最高，均為100%。

1～6.GenBank上公布的大腸桿菌菌毛F41基因序列；7.部分樣品的大腸桿菌F41菌毛基因擴增序列;8.兼性菌毛株的F41菌毛基因擴增序列

2.6 大腸桿菌致病性試驗結果大腸桿菌兼性F41-K99菌毛株、F41菌毛株、K99菌毛株通過小鼠致病性試驗后，小鼠均在攻毒后24 h內出現死亡，死亡小鼠的病變臟器均分離出大腸桿菌(圖7)，3種菌株最小致死劑量分別為1.5×1010,1.5×1011,8×1011CFU/mL，說明分離鑒定的3株大腸桿菌均具有較強的致病性。各菌株低濃度劑量組小鼠均出現精神沉郁、食欲不佳、被毛粗糙、兩眼半閉、全身顫抖、互相扎堆等癥狀,表明3株分離菌均具有致病性，其中兼性菌毛株最小致死劑量最低，致病性較強。

A～C.兼性菌毛株病變臟器鑒別培養結果;D～F.F41菌毛株病變臟器鑒別培養結果；G～H.K99菌毛株病變臟器鑒別培養結果

對死亡小鼠進行解剖，兼性菌毛株致死小鼠可見肝臟腫大，腸道彌漫性出血、脾臟腫大，其他臟器未見異常；F41菌毛株致死小鼠肝臟發白，脾臟腫大，腸道彌漫性出血；K99菌毛株致死小鼠，可見脾臟腫大，腸道出血(圖8),表明3株分離菌均能引起組織器官的病理變化，兼性菌毛株所引起的病理變化最為嚴重。根據分離鑒定的3株菌對小鼠的最小致死量大小、各臟器病變嚴重程度進行比較，得出兼性菌毛株毒力最強，其次是F41菌毛株，最后是K99菌毛株。

A1.兼性菌毛株致死小鼠各臟器情況；4.F41菌毛株致死小鼠各臟器情況;7.K99菌毛株致死小鼠各臟器情況;A2,B2,C2.肝臟;A3,B3,C3.脾臟

3 討論

近年來，我國奶牛場規模不斷擴大，養殖密度不斷增加，在飼養管理條件差和免疫不及時等因素影響下，許多疾病也伴隨而來，危害奶牛的健康，給養殖業造成了巨大的經濟損失。于大腸桿菌的抗原種類繁多，不同地區不同牛場感染的大腸桿菌血清型也不盡相同，給犢牛大腸桿菌病的防制帶來了眾多的困擾。本次研究結果證明河北省部分地區犢牛腹瀉大腸桿菌優勢血清型為O101，為進一步研究和控制大腸桿菌病提供流行病學打下基礎。

本試驗采用血清學方法鑒別大腸桿菌的O抗原，結果河北省4個地區奶牛場有24份大腸桿菌O抗原均與大腸桿菌O101定型血清出現凝集反應；有10份大腸桿菌抗原分別與O102、O104、O78、O15定型血清出現凝集；但是也有一小部分大腸桿菌未鑒定出血清型。可能是由于大腸桿菌耐高溫，在121℃持續2 h也不會改變本身的抗原性，但是位于大腸桿菌細胞壁外側的決定抗原特異性的脂多糖(LPS)容易受物理或化學因素的影響而發生改變，導致抗原的種類無法識別[16]。也有可能由于大腸桿菌抗原種類復雜多樣，導致一小部分大腸桿菌抗原無法被識別。

據報道，大腸桿菌菌毛抗原是引起犢牛腹瀉的重要因素之一，菌毛K99和F41是腹瀉犢牛和羔羊中常見的2種類型，并且具有較強的免疫原性[17-20]。大腸桿菌和其他革蘭陰性菌都是通過菌毛與宿主細胞表面特定受體的結合而產生黏附作用的，所以菌毛黏附素是一類不容輕視的毒力因子。通常一種細菌只表達一種菌毛，但有些菌株可同時表達2種或更多種菌毛，但對細菌攜帶菌毛種類和毒力強弱關系尚不明確[21]。本試驗分離到1株攜帶F41和K99 2種菌毛的大腸桿菌，又將其與單菌毛F41菌株和K99菌株進行攻毒試驗，根據分離鑒定的3株菌對小鼠的最小致死劑量、各臟器病變程度進行比較，得出兼性菌毛株毒力最強，表明細菌攜帶菌毛種類和毒力強弱關系有一定的正相關性。本試驗為下一步研制犢牛腹瀉大腸桿菌疫苗提供數據參考。