大熊貓源產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定

蘇小艷，李運莉，燕 霞，張東升，李 林，侯 蓉，岳嬋娟，劉頌蕊*

(1.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081;2.四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，四川 成都 610081;3.四川省大熊貓科學研究院，四川 成都 610081)

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumonia，Kpn)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，為革蘭陰桿菌；作為一種人獸共患病病原，廣泛分布于人和動物腸道以及自然環境中[1-7]。Kpn能引起典型的原發性肺炎，也能引起各種肺外的感染，如骨髓炎、泌尿道感染及敗血癥等[8-10]。超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是由細菌質粒介導的一類酶，能賦予細菌對頭孢菌素類、單酰胺類(氨曲南)及青霉素類抗生素耐藥[11]。由于產ESBLs-Kpn菌株在攜帶ESBLs質粒的同時，常攜帶對其他抗生素如氟喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類的多種耐藥基因，故可造成多重耐藥[12-13]。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是世界公認的瀕危動物，是生物多樣性保護的旗艦種，屬于國家Ⅰ級保護動物，現分布于四川、甘肅、陜西三省山區。第4次大熊貓普查結果顯示，全國野生大熊貓種群數量達1 864只[14]，目前全國圈養大熊貓種群數量達500只。在圈養大熊貓的疾病防控中會使用抗生素，其中包括β-內酰胺類抗生素。在人醫及動物醫學領域，專家學者對ESBLs-Kpn的臨床分離株在耐藥性、毒力基因和分子流行病學等方面進行了深入研究，這些研究結果為科學有效地防控超廣譜ESBLs-Kpn都起到了積極作用。然而，對于大熊貓源ESBLs-Kpn的分子流行病學研究目前還處于空白狀態。因此，本試驗擬對大熊貓源ESBLs-Kpn進行分離鑒定，探究大熊貓源ESBLs-Kpn在圈養大熊貓中的流行情況和基因型，為臨床合理使用抗生素提供科學依據，也為預防和控制此類細菌的傳播提供系統的實驗數據和參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理2018-2019年共收集某基地圈養大熊貓新鮮糞便390份；用滅菌鑷子夾取少許糞便放入裝有1 mL無菌生理鹽水的無菌EP管中，充分震蕩混勻后接種到腦心浸液(BHI)肉湯中擴菌培養。

1.2 菌株的分離培養與革蘭染色將1.1中的BHI肉湯在無菌條件下接種到麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素瓊脂培養基(MIAC，購自北京陸橋公司)上，37℃培養12～24 h后觀察菌落形態特征。挑選較大、圓凸起、邊緣紅色中間粉白色的具有一定黏度的單菌落進行進一步純化后于37℃搖床振蕩進行單菌落擴增培養。挑取少許菌液進行革蘭染色后觀察菌體形態及染色特征。

1.3 分離菌株的分子生物學鑒定按照TIANGEN?細菌DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。用細菌基因組DNA作為模板，細菌16S rDNA基因通用引物(由生工生物公司合成)擴增細菌的16S rDNA基因，擴增產物大小為1 500 bp。引物序列為：上游引物27F：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′，下游引物1 492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。配制PCR反應體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃延伸10 min。取擴增產物在110 V條件下，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，并將PCR產物送至生工生物公司測序后在NCBI中比對，確定分離菌株的種屬。

1.4 分離菌的同源性分析和系統發育樹的構建GenBank中選取1株Kpn、3株腸桿菌科的不同屬的16S rDNA序列和分離菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-joining法繪制系統發育樹并分析其同源性。

1.5 菌株的生化鑒定將純化好的細菌接種于MH肉湯培養基中培養24 h，使用細菌微量生化反應管進行分離菌株的生化試驗，其操作按文獻[15]方法進行。

1.6 產ESBLs-Kpn菌株的表型鑒定將分離菌株按0.5麥氏濃度均勻涂布于MH平板上進行ESBLs初篩和確證試驗，具體操作按文獻[16]方法進行。

1.7 ESBLs-Kpn菌株的基因型鑒定將表型鑒定篩選出的陽性菌株采用TIANGEN?細菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA。PCR反應體系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物(各引物序列見表1[16])各1 μL、ddH2O 8.5 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性1 min，72℃延伸1 min，共30個循環，72℃延伸10 min，各退火溫度見表1[16]。取擴增產物在110 V條件下，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，將PCR產物送至生工生物公司測序后并在NCBI中比對，確定相應的基因型。

表1 ESBLs基因引物序列信息

2 結果

2.1 菌株的分離培養MIAC培養基上菌落，較大、圓凸起、邊緣紅色中間粉白色的具有一定黏度的菌落判定為疑似Kpn(圖1A)；顯微鏡下觀察菌體形態特征為兩端鈍圓長短不一的革蘭陰性桿菌(圖2B)。本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中根據形態和革蘭染色初步判斷出362株疑似Kpn菌株。

圖1 分離菌株在MIAC培養基上的生長特征(A)和革蘭染色特征(B,1 000×)

2.2 分離菌株的16S rDNA結果和系統發育進化樹構建結果通過PCR擴增細菌16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測在1 500 bp大小處出現條帶(圖2)，將該產物送生工生物公司測序后在NCBI數據庫進行比對，選取相似度大于98%且為Kpn的結果?；蜻M化樹分析結果顯示，分離菌株與Kpn(NR036794.1)的同源性最高，與大腸桿菌(NR024570.1)和志賀菌(NR104901.1)同源性較低，表明該菌株為Kpn(圖3)。對362株疑似Kpn菌株進行16S rDNA鑒定并構建系統發育進化樹進行同源性分析鑒定出211株Kpn。

M.DL2000 DNA Marker;1.為生理鹽水作為陰性對照;2～9.樣品

圖3 部分分離菌株16S rDNA基因序列發育進化樹

2.3 生化鑒定結果通過微量生化反應管對211株菌株進行生化測定，結果如表2所示，分離菌株能發酵麥芽糖、蕈糖、蔗糖、甘露醇、產酸產氣；尿素、葡萄糖試驗結果呈陽性；硫化氫、乳糖試驗呈陰性。將生化試驗結果比對伯杰細菌鑒定手冊[15]，判定211株分離菌株均為Kpn。

表2 分離菌株的生化試驗結果

2.4 ESBLs-Kpn的表型鑒定結果確定為Kpn后通過初篩試驗和確證試驗對ESBLs-Kpn進行表型鑒定。初篩試驗中，從211株Kpn中鑒定出31株疑似ESBLs-Kpn(表3和圖4A)。31株疑似陽性菌ESBLs確證試驗結果顯示，菌株編號為3,30,31的菌株鑒定為ESBLs陽性菌株，分離率為1.42%(表4和圖4B)。對3株ESBLs-Kpn菌株采用PCR技術進行基因型鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測在CTX-M(593 bp)、CTX-M-1(415 bp)、TEM(800 bp)、SHV(713 bp)處出現條帶(圖5)；CTX-M2、CTX-M8、CTX-M9、CTX-M25、GES、PER、VEB、OXA-1、OXA-2在相應大小處未出現條帶。將陽性產物送生工生物公司測序后在NCBI數據庫中進行比對確定基因型得出，3號和31號菌株基因型為blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，30號菌株基因型為blaSHV+blaCTX-M-1。

M.DL2000 DNA Marker;1.3號樣品;2.31號樣品;3.30號樣品;4.陰性對照

表3 ESBLs-Kpn初篩試驗結果

表4 ESBLs-Kpn確證試驗結果

CRO.頭孢曲松;CTX.頭孢噻肟;CAZ.頭孢他啶;CTX/CAL.頭孢噻肟/克拉維酸

3 討論

Kpn可引起大熊貓腸炎和敗血癥[17-18]。ESBLs則是由質粒介導的一種β-內酰胺酶，可以抑制多數青霉素和頭孢菌素，在臨床上增加了Kpn感染后治療的難度。本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中通過MIAC選擇培養基分離出362株疑似Kpn菌株，通過PCR擴增細菌16S rDNA片段后測序比對，結合生化鑒定管結果最終鑒定出Kpn 211株，這提示大熊貓腸道中普遍存在Kpn；對這211株Kpn種進行ESBLs初篩和確證試驗，最后分離出3株ESBLs表型陽性的Kpn，分離率為1.42%。在醫院臨床樣本中，ESBLs-Kpn的分離率為24%～35%[19-20]，而在大熊貓圈養種群中，ESBLs-Kpn的分離率遠遠低于人類醫學臨床樣本，出現這種現象可能有2個方面：一是人類醫學臨床樣本來自于可能已經接受了抗生素治療的患病個體導致菌體耐藥性增加，而本研究中收集的樣本絕大部分為正常大熊貓個體糞便；二是在大熊貓細菌感染的臨床治療過程中，抗生素的使用頻率和種類可能明顯少于人類。但是，在大熊貓圈養種群中已出現了ESBLs-Kpn，因此，在圈養大熊貓臨床治療過程中應合理使用抗生素以避免ESBLs菌株的進一步增加。

全球目前已經發現200多種ESBLs基因型[21]。根據各個酶特性的不同，大致分為SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他類型，如PER、VEB、GES、SPO等[22]。由于抗菌藥物的使用差異及菌株流行的原始地域性差異，所以不同地區流行的ESBLs基因型和耐藥特征都存在一定的差異[9]。西班牙產ESBLs菌株具有高度多樣性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多見[23]；英國以TEM-10和TEM-12為主[24]；韓國以SHV-12、TEM-52和SHV-2a為主；OXA型主要分布于法國及土耳其；美國則常見的為CTXM14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等；我國的ESBLs以CTX-M型及SHV型為主[25-26]。本試驗中所分離的ESBLs-Kpn基因型主要表現出混合基因型的特征，即2株ESBL-Kpn基因型為blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，1株的基因型為blaSHV+blaCTX-M-1，且均含有CTX-M和SHV基因型，說明在圈養大熊貓中出現的ESBLs基因型與國內人群中流行的ESBLs基因型有高度的一致性。

綜上可知，本試驗從390份大熊貓新鮮糞便中分離出3株ESBLs-Kpn陽性菌株且表現出混合基因型的特征，由此說明ESBLs-Kpn菌株已在大熊貓圈養種群中出現。鑒于ESBLs-Kpn菌株感染后的治療難度和造成的危害，在大熊貓等野生動物的臨床治療中應合理使用抗生素，以避免ESBLs-Kpn菌株的進一步增加。