馬皰疹病毒1型gp2基因缺失株的構建及生長特性分析

胡 月，賈欽瑞，吳桂靈，車傳忠，劉建華，加爾肯，冉多良

(新疆農業大學 動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus-1，EHV-1)曾被列為馬鼻肺炎的病原體之一，2012年5月世界衛生組織將其所致疾病稱為馬皰疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)，2020年7月我國農業農村部將該病列為二類動物傳染病[1]。該病毒可引起馬屬動物呼吸系統疾病、孕馬流產、新生馬駒死亡和神經系統疾病，給馬產業造成嚴重的威脅[2]。歷年來，我國的流行病學調查顯示，全國各地區均有EHV-1的流行[3]。2015-2019年，新疆地區該病的平均陽性率為30.47%，成為當前需要重點防控的病毒性傳染病之一[4-5]。

EHV-1具有很強的傳染性，潛伏期長且無特效藥治療，免疫接種是預防該病最有效的手段。目前，我國尚無防控該病的商品化疫苗，主要依賴進口，價格昂貴，故急需一種適用于我國流行毒株的、自主研發的疫苗。FRYMUS等[6]研究表明,EHV-1減毒活疫苗能誘導機體產生體液免疫和細胞免疫應答，其免疫保護效果高于滅活疫苗。EHV-1的gp2蛋白含有817個氨基酸，是病毒復制過程中非必需糖蛋白，與病毒的毒力直接相關。與HSV-1和α亞科其他的病毒相比，gp2是EHV-1編碼的特有的糖蛋白，富含絲氨酸和蘇氨酸，具有很高的免疫原性[7]。因此,本試驗擬以我國流行毒株EHV-1 XJ2015株為親本毒株，采用同源重組方法篩選出gp2基因缺失毒株，為后續EHV-1毒力基因缺失疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞EHV-1 XJ2015株、RK-13細胞系、載體pEGFP-C1和pUC19均由新疆農業大學動物醫學學院傳染病實驗室保存。

1.2 主要試劑2×PrimerSTAR Max購自于北京全式金生物技術有限公司；DNA Marker購自于TaKaRa寶生物(大連)工程有限公司；Gel Extraction Kit 和Cycle Pure Kit購自于OMEGA廣州飛揚生物工程有限公司，LipofectamineTM3000購自于賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設計合成參照EHV-1 XJ2015株的全基因測序結果及pEGFP-C1的序列信息，設計gp2基因左右同源臂和EGFP表達盒的特異性引物及鑒定性引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 轉移載體的構建轉移載體pUC-gp2-LR與pUC-gp2-LR-EGFP構建過程如圖1所示，采用酚-氯仿法提取EHV-1 XJ2015基因組，利用gp2L-F和gp2L-R、gp2R-F和gp2R-R引物PCR擴增gp2基因左右同源臂，參照Gel Extraction Kit說明書回收PCR產物，使用Q.Cut HindⅢ/BamHⅠ、kpnⅠ/EcoRⅠ分別酶切gp2L和gp2R，與pUC19載體連接，轉化至感受態細胞DH5α，將鑒定為陽性的重組質粒pUC-gp2-LR送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。將pUC-gp2-LR和EGFP表達盒片段采用Q.Cut BamHⅠ/kpnⅠ進行酶切，經連接轉化后將鑒定為陽性的重組質粒pUC-gp2-LR-EGFP送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。通過NCBI Blast比對，確保序列正確并按照Endo-free Plasmid Miniprep Kit說明書提取無內毒素質粒，-80℃保存備用。

A.轉移載體pUC-gp2-LR構建策略；B.轉移載體pUC-gp2-LR-EGFP構建策略

1.5 EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+的篩選及純化采用酚-氯仿法提取EHV-1基因組，當RK-13細胞匯合度達到90%時，采用轉染試劑LipofectamineTM3000對轉移載體pUC-gp2-LR-EGFP與EHV-1基因組進行共轉染，轉染后48～72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)，當出現CPE時，用低熔點營養瓊脂鋪板進行重組病毒的蝕斑篩選，挑取最大的熒光蝕斑加入DMEM培養基重懸，反復凍融3次后，4℃下10 000 r/min離心10 min，按10倍系列稀釋接種RK-13細胞中孵育1 h后鋪板培養，重復上述操作直至藍光條件下觀察到的所有病毒蝕斑均呈現綠色熒光。命名純化干凈的重組病毒為EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+。使用△gp2-F和△gp2-R引物進行PCR鑒定。

1.6 EHV-1 XJ2015-gp2-的篩選及純化提取EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+株基因組，將其與轉移質粒pUC-gp2-LR共轉染至RK-13細胞，利用上述方法挑取不發出綠色熒光的蝕斑進行篩選純化，直至所有病毒蝕斑均不發出綠色熒光，命名該病毒為EHV-1 XJ2015-gp2-。使用△gp2-F、△gp2-R、△EGFP-F和△EGFP-R引物進行PCR鑒定。

1.7 重組病毒的生長特性分析RK-13細胞匯合度達到90%時，進行細胞計數；按照常規方法計算病毒感染復數(muhiplieity of infection，MOI)；按MOI=0.1將XJ2015株與XJ2015-gp2-接種至細胞中，并設立正常細胞對照；分別在感染后4,6,12,24,36,48,60,72 h逐一收獲病毒液；反復凍融3次后離心過濾測定病毒液TCID50并繪制病毒的一步生長曲線。按MOI=0.1將XJ2015株與XJ2015-gp2-接種至細胞中；37℃、5%CO2培養箱中孵育1.5 h 后使用低熔點營養瓊脂鋪板培養；3 d后采用中性紅染色并測量蝕斑面積。

2 結果

2.1 左右同源臂的擴增及測序結果利用gp2L和gp2R特異性引物進行EHV-1 XJ2015株gp2基因左右同源臂的擴增，結果顯示分別擴增出1 237 bp和1 235 bp 大小的片段(圖2)，經測序及序列分析結果顯示該片段與相應的基因片段同源性達100%，成功獲得同源臂序列。

M.DL2000 DNA Marker；1.gp2L陰性對照；2.gp2L陽性對照；3.gp2L擴增產物；4.gp2R陰性對照；5.gp2R陽性對照；6.gp2R擴增產物

2.2 轉移質粒pUC-gp2-LR 和pUC-gp2-LR-EGFP 酶切鑒定結果pUC-gp2-LR分別經HindⅢ/BamHⅠ、kpnⅠ/EcoRⅠ酶切和EcoRⅠ酶切，結果顯示1泳道出現3條帶，包括約為1 237 bp(gp2L)的片段；2泳道出現2條帶，包括約為1 235 bp(gp2R)的片段；3泳道出現1條帶，約為5 340 bp(圖3A)，均與預期片段大小相符，表明成功構建pUC-gp2-LR。pUC-gp2-LR-EGFP分別經HindⅢ/BamHⅠ、BamHⅠ/kpnⅠ、kpnⅠ/EcoR Ⅰ酶切，1泳道出現3條帶，包括約為1 237 bp(gp2L)的片段；2泳道出現2條帶，包括大小為1 550 bp(EGFP)的片段；3泳道出現2條帶，包括約為1 235 bp(gp2R)的片段(圖3B)，均與預期片段大小相符，表明成功構建pUC-gp2-LR-EGFP。

M1.DL5000 DNA Marker；A1.HindⅢ/BamHI酶切產物；A2.KpnⅠ/EcoRⅠ酶切產物；A3.EcoRⅠ酶切產物;M2.DL10000 DNA Marker；B1.HindⅢ/BamH I酶切產物；B2.BamHⅠ/KpnⅠ酶切產物；B3.KpnⅠ/EcoRⅠ酶切產物

2.3 EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+的拯救及鑒定pUC-gp2-LR-EGFP與EHV-1 DNA基因組共轉染至RK-13細胞。轉染48 h后收獲病毒液，連續經過7輪蝕斑純化，所有的病毒蝕斑均呈現綠色熒光(圖4)，采用△gp2-F/△gp2-R，EGFP-F/EGFP-R引物對重組病毒EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+進行PCR鑒定。結果顯示，重組病毒可以特異性擴增出大小為1 550 bp的EGFP基因片段，但不能擴增出大小為544 bp的△gp2片段(圖5),表明重組病毒已純化完全。

A.常光下XJ2015-gp2-/EGFP+形成的蝕斑；B.藍光下XJ2015-gp2-/EGFP+形成的蝕斑

M.DL2000 DNA Marker；1.△gp2陰性對照；2.△gp2 PCR擴增產物；3.△gp2陽性對照；4.EGFP陰性對照；5.EGFP PCR擴增產物;6.EGFP陽性對照

2.4 EHV-1 XJ2015-gp2-的拯救及鑒定pUC-gp2-LR與EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+株病毒DNA共轉染至RK-13細胞進行反向重組，經過3輪純化后，所有的病毒蝕斑均不呈現綠色熒光(圖6)，采用EGFP-F/EGFP-R，△gp2-F/△gp2-R引物進行PCR鑒定，結果顯示重組病毒不能特異性擴增EGFP和△gp2片段(圖7)。結果表明,成功拯救并純化獲得了去除EGFP基因的EHV-1gp2基因缺失株。

A.常光下XJ2015-gp2-形成的蝕斑；B.藍光下XJ2015-gp2-形成的蝕斑

M.DL2000 DNA Marker；1.△EGFP陰性對照；2，3.△EGFP PCR擴增產物；4.△EGFP陽性對照；5.△gp2陰性對照；6，7.△gp2 PCR擴增產物；8.△gp2陽性對照

2.5 病毒復制動力學曲線的繪制將親本株與gp2缺失株分別以MOI=0.1感染RK-13細胞，不同時間段收獲病毒后繪制一步生長曲線(圖8)，親本株與gp2基因缺失株的增殖速度及病毒效價存在差異，親本毒在36 h達到最高效價，為10-8.75TCID50/0.1 mL，后者在48 h達到最高效價，為10-6.3TCID50/0.1 mL；gp2基因缺失株測定結果顯示，該毒株增殖能力降低了約2個病毒滴度，表明gp2基因影響病毒增殖能力。

2.6 EHV-1 XJ2015-gp2-毒株與EHV-1 XJ2015株空斑大小的比較將EHV-1 XJ2015-gp2-重組毒株和親本毒以MOI=0.1接種單層RK-13細胞，經吸附，固定培養和中性紅染色等操作后在熒光倒置顯微鏡拍照，隨機各測量50個EHV-1 XJ2015-gp2-毒株和親本毒的獨立空斑面積，平均值分別為0.378 mm2和1.698 mm2，經One-way ANOVA方法分析空斑面積大小顯示，兩者差異極顯著(P<0.01)(圖9)。

圖9 EHV-1 gp2基因缺失毒株和親本毒株的蝕斑形態(A、B)及面積比較(C)

3 討論

目前，本課題組已進行了滅活疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗的初步研制，但上述這些疫苗需與免疫佐劑配合使用，免疫原性較低，需要多次免疫，并建立完善的免疫程序才能達到較好的免疫效果[8]。相比之下，減毒活疫苗的免疫程序較簡單且節約經濟成本，毒力減弱或無毒的活毒株本身即為疫苗株，不需要配合佐劑使用，免疫效果強而持久，但保質期相對較短，存在毒力返租的風險，需要在研發階段進行大量的安全性與穩定性監測[9]。我國對于EHV-1減毒活疫苗的研發還處于開拓階段。

根據XJ2015株的全基因測序及遺傳進化分析表明，gp2基因為該病毒76個基因中保守性最低的基因[10]。而根據VON EINEM等[11]的報道，gp2基因缺失對EHV-1 Ab4、RacL11、RacH、KyA這4株病毒生長的影響存在差異性。本研究測定了EHV-1 XJ2015株和EHV-1 XJ2015-gp2-株在RK-13細胞上的一步生長曲線，結果顯示gp2基因缺失株較親本株增殖能力有所下降，其毒價在病毒增殖的不同時間段均低于親本株，表明gp2基因影響病毒在細胞與細胞之間的傳播。雖然非必需糖蛋白功能的缺失不影響病毒DNA的復制，但是影響了病毒在細胞間的傳播和病毒從細胞中釋放出來的能力，導致病毒吸附到細胞上的效率低于野生型毒株，病毒出膜和釋放時間也受到明顯的推遲。因此gp2基因的缺失可間接影響病毒的增殖。

同源重組是構建重組病毒常用的策略之一，BAC和CRISPR/Cas9等技術是在此基礎上的一些加工和修飾的方法，以提高重組效率[12]。本研究雖采用傳統的同源重組方法，但將轉移載體進行了線性化處理，能提高同源重組的效率；同時使用LipofectamineTM3000試劑轉染，在轉染后每12 h更換1次營養液，使細胞的生長處于良好狀態，為重組病毒的拯救提供了良好的環境；通過篩選得到轉移載體與病毒基因組的最佳轉染比例，提高了轉染和基因重組的效率。此外，本研究通過反向同源重組的方法去除了外源的EGFP基因，排除了機體產生針對外源蛋白的抗體的風險，提高了基因缺失疫苗的穩定性和安全性。

本研究將通過構建EHV-1 XJ2015 US4基因缺失毒株并分析其生物學特性，為我國研發EHV-1基因缺失減毒活疫苗奠定基礎，為預防和控制該病原所引起的馬屬動物疫病提供有效方法。