豬德爾塔冠狀病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立及初步應用

錢炳旭，白雪雁，張成成，郭夢嬌，李夢嬌，廖 凱，薛 峰，吳艷濤，張小榮*

(1.揚州大學 獸醫學院 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225000；2.南京農業大學 動物健康與食品安全國際合作實驗室，江蘇 南京 210095)

豬德爾塔冠狀病毒(porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是2012年首次在中國香港發現的腸道致病性冠狀病毒[1]，可感染各個年齡段的豬，對新生仔豬有較強的致病性，表現為水樣腹瀉、嘔吐，嚴重時會因脫水致死，發病率和病死率較高[2-5]。2014年，美國首次出現PDCoV的大規模流行，俄亥俄州、愛荷華州、伊利諾斯州等多地相繼暴發了仔豬腹瀉，研究人員在發生腹瀉的豬場檢測到PDCoV，并采集病料進行了病毒分離[6-7]。隨后，PDCoV在泰國[8]、加拿大[9]、韓國[10]、中國[11]等地均有出現和報道，呈現全球流行的趨勢，逐漸成為威脅世界養豬業的重要腹瀉病原之一。

PDCoV屬于冠狀病毒科、德爾塔(δ)冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子呈多形性，內部基因組RNA和核衣殼蛋白組成了核蛋白核芯。病毒外膜上有大量棒狀結構突起，直徑為60～180 nm，呈典型的“皇冠”狀冠狀病毒形態[12]。PDCoV的基因組約為25.4 kb，是目前已知的冠狀病毒中基因組最小的，GC含量約為43%。基因組組成、排列順序為：5′非翻譯區(untranslated region，UTR)、開放閱讀框(open reading frame，ORF)1a/1b、棘突蛋白(spike，S)、小膜蛋白(envelope，E)、膜蛋白(membrane，M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid，N)、輔助蛋白NS6、輔助蛋白NS7以及3′端非翻譯區[13]。

PDCoV感染后的病理變化與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)十分相似，主要表現為腸壁變薄、透明(遠端空腸至結腸)，腸腔內有大量淡黃色的液體；組織病理切片可觀察到淺層絨毛上皮腫脹和空泡化；胃中有未消化的凝乳，嚴重者可觀察到胸腔腹腔積液，小腸壁及腸系膜充血、出血[12,14]。所以豬場一旦出現豬腹瀉，在臨床上難以鑒別診斷，確診病原需依賴實驗室檢測。PAN等[15]根據PDCoV的ORF1b基因設計了特異性的引物和探針，建立了一種實時熒光定量PCR方法，檢測限可達1×102拷貝/L。LUO等[16]和LU等[17]分別以M和S蛋白為靶蛋白，建立了快速、簡便的檢測血清和乳汁中抗體的間接ELISA方法，可用于PDCoV的臨床診斷和疫苗免疫評價。N蛋白是冠狀病毒粒子中數量最多的結構蛋白，高度保守[18]，因此本試驗選擇N蛋白作為靶蛋白，建立了用于PDCoV特異性抗體檢測的間接ELISA方法，從而為PDCoV感染的快速診斷和流行病學監測提供快速、準確、有效的高通量檢測手段。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株表達載體pET-32a，購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 血清PDCoV、PEDV、TGEV、豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PRoV)等抗血清均由揚州大學獸醫學院傳染病重點實驗室制備和保存。

1.3 主要試劑T4DNA連接酶、TMB substrate kit和限制性內切酶均購自Thermo Fisher公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬IgG和羊抗鼠IgG購自Sigma公司；小量提取質粒試劑盒與膠回收試劑盒均購自Axygen公司；His標簽蛋白的單克隆抗體和Ni-NTA親和層析介質均購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.4 PDCoV N蛋白的原核表達及純化

1.4.1PDCoV N蛋白原核表達質粒的構建 通過DNAStar軟件包中的Protean程序，對PDCoV CHN/Tianjin/2016株N蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號：KY065120)進行分析，挑選其中抗原性較好的一段(265～342 aa)，根據大腸桿菌密碼子使用的偏嗜性規律，對其基因片段進行密碼子優化設計，為方便克隆，基因片段兩端分別加上BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶識別位點，優化的基因片段N-Opti委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ將人工合成的N基因片段定向克隆入原核表達載體pET-32a相應位點之間，獲得重組質粒pET-32a-PDCoV-N-Opti(圖1)。

圖1 pET-32a-PDCoV-N-Opti重組質粒圖譜

1.4.2PDCoV N蛋白的誘導表達與鑒定 將重組質粒pET-32a-PDCoV-N-Opti轉化到BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞中，獲得重組表達菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti。將重組菌1∶100接種于含有氨芐青霉素(100 g/mL)的LB液體培養基中，培養至菌液D600 nm值在0.4～0.6之間，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG進行誘導表達，同時設立BL21(DE3)/pET-32a的陰性菌對照，進行SDS-PAGE和Western blot試驗以分析PDCoV-N-His蛋白的表達情況。

1.4.3PDCoV N蛋白的純化 利用Ni-NTA親和層析介質純化PDCoV-N-His蛋白，參照說明書配制試劑，使用含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫蛋白，完成后收集蛋白濾液、洗滌液、洗脫液，進行SDS-PAGE，觀察蛋白條帶，分析純化效果。

1.5 檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法的建立

1.5.1抗原最佳包被質量濃度和一抗最佳稀釋度的確定 棋盤滴定法確定抗原最佳包被濃度和一抗血清最佳稀釋度。PDCoV-N-His蛋白用碳酸鹽包被液按8.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/L質量濃度梯度進行稀釋，PDCoV陽性血清和豬陰性血清用PBST稀釋1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400的梯度，進行間接ELISA檢測，比較P/N值，選擇P/N最大值對應孔的抗原包被濃度和一抗血清稀釋度作為最佳工作濃度。

1.5.2最佳封閉條件的確定 分別以1% BSA、5%脫脂乳、5%馬血清、5%小牛血清作為封閉液，每種封閉液設立30，60，90，120 min的孵育時間梯度，PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，進行間接ELISA檢測，比較各組陰陽性血清的P/N值，選擇P/N值最大的封閉液和封閉時間作為最佳封閉條件。

1.5.3最佳一抗和底物孵育時間的確定 一抗孵育時間設立30，60，90，120 min的時間梯度，底物顯色時間設立10，15，20，25 min的時間梯度，PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，進行間接ELISA檢測，比較各組陰陽性血清的P/N值，分別選擇P/N值最大的孵育時間為最佳條件。

1.5.4酶標二抗最佳孵育條件的確定 根據已確定的最佳條件，兔抗豬IgG-HRP按照1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的梯度進行稀釋，每個稀釋度再設30，60，90，120 min的孵育時間梯度，PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，進行間接ELISA檢測，比較各組陰陽性血清的P/N值，選擇P/N值最大的二抗稀釋度和孵育時間為最佳條件。

1.5.6特異性試驗 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測PEDV、TGEV、PRoV陽性血清，同時設立PDCoV陽性血清和豬陰性血清的對照，驗證ELISA方法的特異性。

1.5.8間接ELISA方法的初步應用 應用本研究所建立的檢測PDCoV抗體的間接 ELISA 方法，對本實驗室保存的20份PDCoV豬陽性血清樣品和20份豬陰性血清進行檢測，以驗證間接ELISA方法的檢測結果是否可靠。

2 結果

2.1 PDCoV N蛋白的原核表達

2.1.1原核表達質粒的酶切鑒定 利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質粒進行酶切鑒定，結果如圖2，可見重組質粒的酶切產物可產生5.4 kb 大小的載體條帶和234 bp大小的目的條帶，空載體pET-32a則僅觀察到1條5.4 kb的載體條帶。

M.100 bp DNA Marker；1.pET-32a-PDCoV-N-Opti；2.pET-32a

2.1.2PDCoV N蛋白的SDS-PAGE鑒定 如圖3所示，重組菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti的表達產物蛋白相對分子質量約為31 kDa，與PDCoV-N-His重組蛋白的相對分子質量大小一致，并且表達產物主要存在于上清中，表明重組N蛋白呈可溶性表達。

M.蛋白Marker；1.重組菌/上清；2.重組菌/沉淀；3.陰性對照/上清；4：陰性對照/沉淀

2.1.3Western blot分析 取1.4制備的蛋白樣，以His蛋白的單抗(1∶1 000稀釋)為一抗，以HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，稀釋液均為5%脫脂乳，進行Western blot分析。結果如圖4所示，可見重組菌裂解產物在31 kDa處有特異性蛋白條帶，而陰性菌的裂解產物僅在20 kDa處有特異性條帶，與His標簽蛋白分子量大小相符，說明重組蛋白PDCoV-N-His在表達過程中，融合了載體上的His標簽蛋白成功表達。

M.蛋白Marker；1.重組菌/上清；2.重組菌/沉淀；3.陰性對照/上清；4.陰性對照/沉淀

2.1.4PDCoV N蛋白的純化 使用Ni-NTA親和層析介質純化PDCoV-N-His蛋白，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。PDCoV-N-His蛋白純化后的洗脫液在31 kDa有較為單一的蛋白條帶(圖5)，與預期相符，純化效果較好，蛋白質量濃度為2.2 g/L。將純化后的重組蛋白透析到PBS(pH7.4)中，-20℃ 保存備用。

M.蛋白Marker；1.PDCoV-N-His蛋白；2.PDCoV-N-His蛋白濾液；3,4.洗滌液；5.洗脫液

2.2 PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法的建立

2.2.1抗原最佳包被質量濃度和血清最佳稀釋度的確定 采用棋盤滴定法，確定最佳抗原包被質量濃度和血清稀釋倍數。PDCoV-N-His重組蛋白質量濃度8.000～0.125 mg/L倍比稀釋，PDCoV陽性血清和豬陰性血清進行1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800倍稀釋，每個血清設3個重復，進行間接ELISA檢測，讀取D450 nm值。結果如圖6所示，最佳抗原包被質量濃度為1 mg/L，最佳血清稀釋倍數為1∶100。

圖6 抗原包被濃度及血清稀釋倍數的確定

2.2.2最佳封閉條件的確定 分別以1% BSA、5%脫脂乳、5%馬血清、5%類胎牛血清作為封閉液，每個封閉液孵育時間設立30，60，90，120 min的梯度，PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，進行間接ELISA檢測，讀取D450 nm值。結果如圖7所示，最佳封閉液為1% BSA，最佳封閉時間為60 min。

圖7 封閉液和封閉時間的確定

2.2.3最佳一抗孵育時間和底物顯色時間的確定 一抗孵育時間設立30，60，90，120 min的梯度，底物顯色時間設立10，15，20，25 min的時間梯度，PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，進行間接ELISA檢測，讀取D450 nm值。結果如圖8所示，一抗的最佳孵育時間為60 min。

圖8 一抗孵育時間和底物顯色時間的確定

2.2.4酶標二抗最佳孵育條件的確定 PDCoV陽性血清和豬陰性血清作為一抗，每份血清各做3個重復，兔抗豬IgG-HRP設立1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的稀釋梯度，每個稀釋度的孵育時間設立30，60，90，120 min的梯度，進行間接ELISA檢測，讀取D450 nm值。結果如圖9所示，兔抗豬IgG-HRP的最佳稀釋度為1∶5 000，最佳孵育時間為60 min。

圖9 兔抗豬IgG-HRP稀釋度和孵育時間的確定

2.2.6特異性試驗 使用建立的間接ELISA方法檢測PEDV、TGEV、PRoV血清，同時設立PDCoV 血清和豬陰性血清對照，每份樣品均設立3個重復，讀取D450 nm值。結果如圖10所示，PEDV、TGEV、PRoV血清和豬陰性血清的D450 nm值均小于臨界值0.3，判定為陰性；PDCoV陽性血清的D450 nm值大于臨界值0.3，判定為陽性。結果表明建立的間接ELISA方法可與PDCoV抗體特異性反應，具有良好的特異性。

圖10 間接ELISA方法的特異性試驗結果

2.2.7重復性與穩定性試驗 使用建立的間接ELISA方法檢測8份PDCoV陽性血清樣品，每個樣品重復4次，讀取D450 nm值。經統計學分析，結果如表1所示，方法的批內變異系數為2.0%～3.5%，批間變異系數為5.8%～9.7%，變異范圍均小于10%，表明本研究建立的間接ELISA檢測方法具有較好的重復性和穩定性。

表1 批內和批間重復性試驗變異情況

2.2.8間接ELISA方法的初步應用 應用本研究建立的檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法，對本實驗室保存的20份PDCoV陽性血清(1～20)和20份豬陰性血清(21～40)進行檢測，讀取D450 nm值。結果如表2所示，20份陽性血清檢測結果均為陽性，陽性符合率為100%(20/20)；20份陰性血清檢測結果均為陰性，陰性符合率為100%(20/20)，表明間接ELISA方法的檢測結果準確、可靠，具有臨床應用價值。

表2 間接ELISA方法對40份血清的檢測結果

3 討論

PDCoV是一種新發現的腸道致病性冠狀病毒，主要引起新生仔豬腹瀉，發病率和病死率較高。PDCoV在我國各地廣泛流行，如四川、黑龍江、天津、河南等地均有該病毒的相關報道。有研究顯示[19]，目前PDCoV感染已成為導致我國新生仔豬死亡的重要原因之一。PDCoV感染仔豬的臨床癥狀與豬流行性腹瀉(PED)和豬傳染性胃腸炎(TGE)非常相似，臨床上難以鑒別診斷。因此，本研究的目的是建立用于PDCoV特異性抗體檢測的間接ELISA方法，從而為PDCoV感染的快速診斷和流行病學監測提供快速、準確、有效的檢測手段。

PDCoV N蛋白是具有高度保守性和種屬特異性的結構蛋白，且在PDCoV感染細胞過程中產生量最大，病毒感染宿主后最早可檢出的抗體也是針對N蛋白的特異性抗體[20]，因此，以N蛋白作為目標蛋白建立PDCoV感染相關檢測技術具有重要意義。SU等[21]通過大腸桿菌原核表達系統，制備了PDCoV N重組蛋白，表達的N蛋白能特異性結合PDCoV抗血清，具有良好的特異性，然而該研究中表達的N蛋白基本以包涵體形式存在。通常情況下以包涵體形式表達的重組蛋白在純化環節操作較為復雜，耗費時間較長，且在蛋白變性和復性的過程中容易失敗，更為重要的是包涵體蛋白的免疫原性比可溶性蛋白差，應用價值相對較低。為了使原核表達的PDCoV N蛋白具有可溶性且保持更好的免疫原性，本研究依據生物信息學分析和大腸桿菌密碼子使用偏嗜性規律，設計、合成了N-Opti基因片段，并將其克隆入融合表達載體pET-32a多克隆位點中，構建表達質粒。表達載體pET-32a攜帶的His可溶性標簽蛋白可以和PDCoV N蛋白進行融合，促進蛋白正確折疊，從而提高目的蛋白的可溶性，并且可以通過標簽蛋白純化PDCoV N重組蛋白，簡化純化的步驟。本研究經誘導表達和純化，成功制備了高純度、可溶性重組蛋白PDCoV-N-His，一系列生物學特性試驗結果顯示制備的重組蛋白具有良好的免疫原性和特異性，為后續PDCoV抗體間接ELISA檢測方法的建立奠定了堅實的基礎。

以可溶性的PDCoV N重組蛋白為包被抗原，并優化各步反應條件，建立了特異性檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法。為了驗證其檢測效果，使用該方法檢測20份已知背景的PDCoV陽性血清和20份豬陰性血清，結果顯示陽性符合率為100%(20/20)，陰性符合率為100%(20/20)，表明建立的檢測PDCoV抗體的間接ELISA方法具有實際應用價值，為豬群中PDCoV感染的抗體水平監測、快速診斷和流行病學調查提供了一種血清學檢測方法。

由于目前國內外尚未研制出預防PDCoV感染的疫苗，因此豬群只要檢出PDCoV抗體陽性，就可以確診為PDCoV感染。本研究建立的針對PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法適用于PDCoV感染流行病學調查中對于大批樣品的篩查，也為豬群中PDCoV感染的快速診斷、流行病學調查和抗體水平監測提供了準確而有效的檢測手段。