靜電紡PU納米纖維膜及其固定化酶的研究

張群華，范小平，劉媛，袁文波，周愛梅，王國慶，陳贛

(1.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642；2.吉安井岡農業生物科技有限公司，江西 吉安 343000)

柚苷酶(Naringinase)是一種由α-L-鼠李糖苷酶以及β-D-葡萄糖苷酶兩種酶組合而成的復合酶[1]，其不僅在柚柑類水果加工以及給食品增添香味中發揮作用，還可以用于生產抗生素、生物轉化類固醇和皂苷等[2-3]。然而游離柚苷酶對周圍環境敏感，在極端pH值、溫度等因素的作用下容易失活。為解決這一問題，將游離酶固定在非溶性載體上來提高酶的穩定性和重復利用率成為了一種簡便經濟的方法[4]。

本研究選用生物相容性和機械性能俱佳的聚氨酯(PU)材料，采用電紡技術制備PU納米纖維膜(PUNF)，并用殼聚糖(CTS)對纖維膜表面進行親水改性，引入功能性基團，有效固定柚苷酶，提高酶的負載量和增強酶的穩定性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚氨酯(PU)，工業塑料；柚苷酶制劑(酶活 10 000 U/g)，食品級；丙酮(含量≥99.5%)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，含量≥99.5%)、柚皮苷(純度≥99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，含量≥98.5%)、N-羥基珀酰亞胺(NHS，含量≥98%)、殼聚糖(CTS，脫乙酰化≥95%)、氫氧化鈉、乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純；所用蒸餾水為一級水。

E02型靜電紡絲機；BS1240S型電子天平；HJ-4A型數控恒溫多頭磁力攪拌器；KQ-100DE型數控超聲波清洗機；Sdc-100接觸角測量儀；Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀；Tescan Vega 3 S型掃描電鏡；T6型新世紀紫外可見分光光度計。

1.2 酶膜的制備

1.2.1 PUNF制備 用電子天平稱取12 g的PU顆粒，加入到體積比為67∶33的丙酮和DMF溶劑中[5]，在室溫下用磁力攪拌器隔夜攪拌12 h，至完全溶解，獲得聚合物溶液。在室溫條件下，用注射器吸取5 mL的紡絲液，置于紡絲機的注射泵上，調節接收距離為22 cm，設置紡絲電壓為22 kV，注射的速率為0.5 mL/h，接收器滾輪轉速為300 r/h，待接收裝置上收集到一定厚度的PU膜，即停止紡絲。將膜放置到恒溫干燥箱中，烘30～45 min，待溶劑完全揮發后密封保存。

1.2.2 PUNF活化 將PU膜剪切成4 cm×4 cm的膜，用滴管吸取磷酸緩沖液(PBS)沖洗膜的表面，去除膜的表面雜質。配制摩爾比為1∶2的EDC/NHS溶液，放入清洗過的PU納米纖維膜，于25 ℃恒溫水浴中反應2 h后拿出。

1.2.3 PUNF改性 活化的PU納米纖維膜，用大量去離子水多次沖洗，除去膜表面附著的活化劑。配制一定濃度的CTS溶液(CTS用2%的乙酸溶解)，將活化后的膜浸泡在CTS溶液中，在25 ℃水浴下振蕩。以不同的CTS濃度為梯度，探究最佳改性參數。取出膜，用去離子水多次沖洗附著的CTS，將膜晾干，保存備用。

1.2.4 酶膜制備 準備潔凈燒杯，電子天平精確稱量一定質量的柚苷酶制劑放入其中，加入去離子水至溶解完全，于4 ℃下保存。量取30 mL柚苷酶溶液，將PU納米纖維膜浸泡在其中，置于4 ℃下反應12 h。取出已固定柚苷酶的PU納米纖維膜，用去離子水多次洗滌，保存好原酶液、固定化后酶液以及清洗液。將沖洗后的纖維膜晾干，并保存在4 ℃的環境下。

1.3 測試與表征

1.3.1 靜電紡PU納米纖維膜的表征 采用掃描電子顯微鏡對靜電紡納米纖維膜的形貌進行觀察，并用Nano measurer軟件測量纖維的平均直徑。使用接觸角測量儀對納米纖維膜進行接觸角的測量。對靜電紡納米纖維膜進行傅里葉變換紅外光譜分析，設置掃描范圍為500～4 000 cm-1，判斷改性后納米纖維膜上基團的情況。

1.3.2 載酶量測定 取潔凈試管，分別取1 mL固定前的酶溶液、固定化酶后的溶液以及清洗固定化酶膜所用的溶液于試管中，加入4 mL考馬斯亮藍G-250染料試劑，輕搖混勻，分別取三組平行試樣，在分光光度計595 nm 的波長處檢測對應的吸光值，代入蛋白標準曲線中，得到固定前后酶溶液以及清洗酶膜液的相應濃度[6]。以下式計算納米纖維膜上柚苷酶的負載量。

式中G——納米纖維膜上的酶固定量，mg/g；

C0，C1——分別表示固定化酶前后酶溶液中酶含量，mg/mL；

C2——沖洗固定化酶膜的去離子水中酶的含量，mg/mL；

V0——原始酶溶液的體積，mL；

V2——清洗酶膜所用的去離子水的體積，mL；

M——聚氨酯納米纖維膜的質量，g(干重)。

1.3.3 柚苷酶酶活力的測定 參考Davis法[7]，用pH為 4.5的緩沖液配制濃度0.8 g/L的柚皮苷溶液。試劑瓶中放入酶膜，加入0.8 mL柚皮苷溶液，在50 ℃的恒溫水浴中反應30 min。量取0.1 mL反應后的酶解液于試管中，加入0.1 mL濃度4 mol/L的 NaOH溶液以及5 mL體積分數為90%的一縮二乙二醇溶液，充分混合均勻后靜置10 min。用分光光度計在波長420 nm處測定吸光值。

柚苷酶酶活力(U)的定義：在 pH 4.5，50 ℃條件下，每分鐘降解1 μg柚皮苷所需的酶量為一個酶活力單位。酶比活力(U/g或U/mL)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 g固定化柚苷酶(或 1 mL 游離柚苷酶)所表現出的酶活力。相對酶活力(%)按下式計算。

相對酶活力=(酶活力/最高酶活力)×100%

2 結果與討論

2.1 掃描電鏡表征

圖1是質量分數為12%的PU紡絲液在接收距離為22 cm，紡絲電壓為22 kV，注射速率為 0.5 mL/h，接收器滾輪轉速為300 r/h的紡絲參數下制得的纖維膜的微觀結構。

圖1 PU納米纖維膜掃描電鏡圖Fig.1 SEM of PU nanofilm

由圖1可知，紡得的PU納米纖維膜的纖維表面無串珠狀結構，纖維不粗糙，整體較為光滑，說明噴絲頭處的液滴在電場作用下能夠很好地被拉伸成絲，通過靜電紡絲獲得了具有較好纖維樣貌的納米纖維膜。由圖2可知，纖維絲直徑主要分布在450～500 nm范圍內，纖維絲較細。

圖2 納米纖維膜直徑分布圖Fig.2 Distribution of nanofilm diameter

2.2 接觸角測量

測量CTS親水改性前后PUNF的接觸角，結果見圖3。

由圖3可知，CTS改性前，PU納米纖維膜的接觸角為124.5°，即納米纖維膜表現為疏水性；CTS親水改性后，PU納米纖維膜的接觸角為72.8°，表現為親水性。這是因為CTS分子結構中含有大量的氨基和羥基親水基團，使得纖維膜的親水性得到良好的改善[8]。

圖3 改性前后PUNF的接觸角Fig.3 Measurement of contact angle before (a) and after (b) modification a.改性前；b.改性后

2.3 傅里葉變換紅外光譜

圖4是PU原膜、PU-CTS膜和PU-CTS-酶膜的紅外吸收光譜圖。

圖4 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectrum

由圖4可知，經接枝CTS后的膜相較于原膜，在2 924 cm-1增加了一個吸收峰，在3 332 cm-1處的吸收峰值增大，這可能是接枝CTS后引入的CH2—OH基團。酶膜在705 cm-1處出現了一個吸收峰，這可能是酶上的氨基酸的COO變角振動，因此可判斷柚苷酶成功地固定在了PU納米纖維膜上。

2.4 殼聚糖濃度對載酶量及其酶活力的影響

CTS質量濃度測試結果見圖5。

圖5 殼聚糖濃度對膜上載酶量的影響Fig.5 Effect of CTS concentration on loading amount of PU nanofilm

由圖5可知，當PU膜接枝了CTS后，使得膜的載酶量有了較大幅度的提升，可能是由于CTS上的親水基團為柚苷酶提供了更多的接枝位點。載酶量隨著CTS的濃度增大而增大，CTS濃度0.5%時，PU膜上的載酶量達到最大值，為83.2 mg/g。CTS濃度>0.5%時，載酶量下降，這可能是由于空間位阻的影響，在PU膜上的纖維表面所排列的CTS過于緊密，導致柚苷酶與膜之間的傳質通道受到限制。

由圖6可知，CTS濃度增加時，柚苷酶的相對酶活性隨之增大，CTS濃度為0.5%時，柚苷酶酶活力達到最大值。隨著CTS濃度的增加，對PU膜的親水改性效果越好，良好的親水性可以給柚苷酶提供一個微水環境，有利于酶活性的保持[9]，所以柚苷酶的酶活力逐漸增加。而后隨著濃度增大，酶活力呈現下降趨勢，一方面可能由于在柚苷酶對柚皮苷進行分解作用的過程中，PU膜上固定的柚苷酶量出現了下降的趨勢，載酶量的下降使得對柚皮苷的脫苦率有所下降；另一方面是CTS濃度的增加，導致纖維膜內部空間受影響，酶與底物催化的傳質阻力增大。

圖6 殼聚糖濃度對固定化酶的酶活力的影響Fig.6 Effect of CTS concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.5 溫度對酶活力的影響

一般情況下，酶催化底物的速率開始時隨溫度的增加而逐漸升高，待溫度到達一定值，由于溫度過高使得酶蛋白發生變性而抑制其活性，導致酶解反應速率降低[10]。因而探究了溫度對柚苷酶活力的影響，情況見圖7。

圖7 酶解溫度對固定化酶的酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on relative activity of immobilized enzyme

由圖7可知，游離柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，在溫度50 ℃時具有最高酶活力。在30～50 ℃和50～70 ℃時，固定化柚苷酶的酶活力均高于游離柚苷酶的酶活力，說明經固定化后，酶溫度穩定性得到了提高。

2.6 酶解時間對酶活力的影響

圖8是在不同的時間長度下分別用游離酶和固定化酶對柚皮苷進行脫苦，對比不同時間下柚苷酶的相對酶活性。

圖8 酶解時間對固定化酶的酶活力的影響Fig.8 Effect of time on relative activity of immobilized enzyme

由圖8可知，在脫苦時間為0.5 h時，固定化柚苷酶的酶活性反而比游離酶低，這可能是受載體影響，酶與底物接觸需要經過一段傳質通道，因而剛開始的時候固定化酶酶活性會低于游離酶。隨著時間的增加，柚苷酶與柚皮苷越來越充分的接觸，使得催化效果越好，因此固定化柚苷酶的酶活力也逐漸增加，直至催化反應時間為1.5 h時，酶活性達到最大值。而游離酶在催化時間為1 h時達到最大酶活力后，隨著時間推移，酶活力逐漸下降，可能是因為游離狀態的酶操作穩定性不佳，因而隨時間的延長酶活性呈自然下降趨勢。

2.7 pH值對酶活力的影響

用不同pH值的緩沖溶液配制柚皮苷溶液，向不同pH的底物中分別加入游離酶和固定化酶膜，50 ℃條件下反應1 h測定酶活力。

由圖9可知，游離柚苷酶和固定化柚苷酶的酶活力均先上升后下降，且同時在pH為4～5之間時酶活力達到最大值。然而在pH為2～4和4～6之間時，固定化柚苷酶的酶活力均高于游離柚苷酶的酶活力，說明經固定化后的酶pH穩定性得到了提高。

圖9 酶解pH值對固定化酶的酶活力的影響Fig.9 Effect of pH on relative activity of immobilized enzyme

3 結論

(1)在PU紡絲液質量分數為12%，紡絲參數為：接收距離22 cm，紡絲電壓22 kV，注射速率 0.5 mL/h，接收器滾輪轉速300 r/h的條件下可獲纖維形貌良好的納米纖維膜。

(2)使用CTS對PU膜進行親水改性，使得納米纖維膜有親水性，膜上接枝了作為親水基團的羥基，當殼聚糖濃度為0.5%，聚氨酯膜有最佳的載酶量，為83.2 mg/g，對柚皮苷催化活力達到最大值。

(3)經過固定化的柚苷酶相較于游離酶，在一定的催化時間、pH和溫度范圍內均表現出更高的穩定性。