MiR-21靶向調控PTEN對胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響*

李紅敏 方 容 鄒 琴

武漢市第四醫院消化內科1(430030) 檢驗科2

背景：胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，miR-21可調節磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)蛋白表達，誘導多種腫瘤細胞凋亡。目的：探討miR-21靶向調控PTEN對胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法：將對數生長期SGC-7901細胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對照組和空白對照組，采用RT-PCR和蛋白質印跡法分別檢測miR-21和PTEN mRNA和蛋白表達，螢光素酶報告基因試驗驗證兩者的靶向關系。將胃癌SGC-7901細胞分為空白對照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組，以CCK-8法檢測細胞增殖活性，TUNEL法檢測細胞凋亡情況，Transwell法檢測細胞侵襲力，劃痕實驗檢測細胞遷移力，蛋白質印跡法檢測Ki-67、PCNA、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達。建立裸鼠成瘤模型，檢測過表達miR-21對移植瘤體積和質量的影響。結果：MiR-21可靶向負調控PTEN表達。與NC組相比，miR-21組細胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05)，細胞凋亡率下降(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達升高(P<0.05)，PTEN、cleaved caspase-3表達下降(P<0.05)；PTEN組細胞增殖、侵襲和遷移率下降(P<0.05)，細胞凋亡率升高(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達下降(P<0.05)，PTEN和cleaved caspase-3表達升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細胞增殖、侵襲和遷移率升高(P<0.05)，細胞凋亡率下降(P<0.05)，Ki-67、PCNA、Bcl-2/Bax比例、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達升高(P<0.05)，PTEN、cleaved caspase-3表達下降(P<0.05)。與對照組相比，過表達miR-21可增加裸鼠移植瘤的體積和質量(P<0.05)。結論：MiR-21可靶向負調控PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路，促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，并抑制細胞凋亡。

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，早期主要表現為非特異性消化道癥狀，隨疾病發展表現為疼痛、體質量減輕、貧血、惡病質等，預后較差[1]。目前，胃癌的治療主要采用手術聯合術前、術中和術后化療的方式，但術后易發生復發和轉移[2]。微RNA-21(miR-21)是miRNA家族的成員，參與調控多種細胞的增殖、分化和凋亡等生理過程，近年研究顯示，miR-21在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達[3-4]。既往有研究[5]顯示，miR-21可靶向調控磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)的表達，誘導肝癌細胞凋亡。PTEN是一種腫瘤抑制基因，在胃癌細胞中異常低表達，可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲[6]。Pan等[7]的研究顯示，PTEN可抑制磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路的表達，抑制胃癌細胞的惡性生物學行為。但miR-21靶向PTEN調節胃癌細胞惡性生物學行為的具體機制尚不明確。本研究通過干擾miR-21，并分析miR-21靶向調控PTEN對胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，旨在探討miR-21靶向PTEN調節胃癌細胞惡性生物學行為的機制，從而為胃癌臨床治療和新靶向藥物的研發提供一定的理論依據。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

1. 實驗動物：20只SPF級BALB/c裸鼠，雄性，鼠齡4～5周，體質量(20±2) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有實驗動物均飼養于武漢市第四醫院實驗動物中心，飼養期間各組小鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料，由湖北省實驗動物研究中心提供。飼養環境室溫為22～25 ℃，模擬晝夜光照。所有操作均符合武漢市第四醫院動物實驗倫理學要求，且本批次裸鼠腫瘤體積的實驗終點符合實驗動物福利。

2. 實驗試劑：MiR-21 mimic(正義鏈：5’-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3’，反義鏈：5’-AAC AUC AGU CUG AUA AGC UAU U-3’)、miR-21 inhibitor(正義鏈：5’-UCA ACA UCA GUC UGA UAA GCU A-3’， 反義鏈：5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA GUA CAA-3’)、miRNA-NC(5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3’)、p-miR-Report質粒、PRL-K載體、慢病毒過表達載體pLV-DNA均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；細胞培養基RPMI-1640和胎牛血清購自上海滬震生物科技有限公司；pMIR-Report Luciferase質粒購自上海信裕生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自上海鈺博生物科技有限公司；螢光素酶報告基因試驗檢測試劑盒購自美國Promega公司；CCK-8檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司；Transwell小室(包被Matrigel基底膜)購自美國BD公司；Bcl-2、Ki-67、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Bax、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt抗體均購自美國Santa Cruz公司；β-actin鼠單克隆抗體和HRP標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術公司。

3. 實驗儀器：7500實時熒光定量PCR儀、全自動酶標儀(Thermo Fisher Scientific)；MF-ChemiBIS凝膠成像系統(DNR Bio-Imaging Systems)。

二、實驗方法

1. 細胞培養和轉染：人胃癌SGC-7901購自美國典型物種保藏中心。將SGC-7901細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養，隔天換液。將對數生長期細胞分為miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor組、陰性對照組和空白對照組，應用LipofectamineTM2000試劑分別轉染miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、無意義的mimic，空白對照組不做任何處理。

2. RT-PCR檢測miR-21和PTEN表達：Trizol法提取細胞總RNA，進行實時定量PCR。MiR-21上游引物：5’-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TGA TG-3’，下游：5’-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3’，以U6作為內參，上游引物：5’-CCC GGA CAC GTG GGC TCC C-3’，下游：5’- CAC ATC CCT GGA CAC AGT CCT AG-3’。反應條件：95 ℃預熱5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環。PTEN上游引物：5’-AGG GAG TCA CAA TTC CCA GTC-3’，下游：5’-AGG TTT CCT CTG GTC CTG GTA T-3’，以GAPDH為內參，上游引物：5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’，下游：5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TGT C-3’。反應條件：95 ℃預熱5 min；95 ℃變性10 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 min，30個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-21和PTEN的相對表達水平。

3. 螢光素酶報告基因試驗驗證miR-21與PTEN的靶向關系：根據miRNA靶點預測軟件，miR-21可與PTEN mRNA的3’-UTR區420～437位點內的部分堿基互補配對(圖1)，體外合成含該位點(PTEN 3’-UTR WT)及其位點突變體(PTEN 3’-UTR MUT)的pMIR-Report Luciferase質粒。將該質粒、PRL-K載體混勻，與miR-21 mimic共轉染SGC-7901細胞，mimic NC組轉染miR-NC，培養48 h后測定螢光素酶活性，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

圖1 MiR-21與PTEN mRNA的3’-UTR區堿基互補配對

4. 實驗分組：將對數生長期SGC-7901細胞分為空白對照組、NC組、miR-21組、PTEN組和miR-21+PTEN組。轉染前24 h接種細胞，NC組轉染無意義mimic，miR-21組轉染miR-21 mimic，PTEN組轉染PTEN，miR-21+PTEN組轉染PTEN和miR-21 mimic。

5. CCK-8法檢測細胞增殖：取各組轉染后的對數生長期SGC-7901細胞，以1×106個/孔接種于96孔板；置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h；檢測波長為570 nm處各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(轉染組細胞A值/對照組細胞A值)×100%。

6. TUNEL法檢測細胞凋亡：取各組轉染后的對數生長期SGC-7901細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于12孔板。培養48 h后，制作細胞涂片，進行TUNEL染色，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察陽性細胞數。

7. Transwell法檢測細胞侵襲力：取各組轉染后的對數生長期SGC-7901細胞，取100 μL稀釋的細胞懸液(2×105個/mL)加于Transwell上室(包被Matrigel基底膜)，上室加入無血清培養基，37 ℃ 5% CO2條件下培養48 h后取出Transwell小室，進行常規的固定、染色，觀察計數膜的下室面表面的細胞。

8. 劃痕實驗檢測細胞遷移力：取各組轉染后的對數生長期SGC-7901細胞，接種于6孔板(1×105個/mL)。常規培養，待細胞鋪滿孔底單層，采用無菌槍頭在皿底中間劃一直線，拍照，洗滌3次，繼續培養12 h，顯微鏡下觀察培養前后劃痕寬度，計算細胞的遷移率。

9. 蛋白質印跡法檢測蛋白表達：取各組轉染后的對數生長期SGC-7901細胞，提取各組細胞總蛋白，以β-actin為內參，檢測PTEN(1∶1 000)、Ki-67(1∶500)、PCNA(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、cleaved caspase-3(1∶500)、Bax(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)蛋白表達，電化學發光法顯影，凝膠成像系統分析目的蛋白的表達。

10. 裸鼠移植瘤模型建立和分組：20只SPF級裸鼠預飼養1周后，隨機分為對照組和miR-21組，每組各10只。取NC組和miR-21組對數生長期SGC-7901細胞，制成1×107個/mL的單細胞懸液，分別注射于對照組和miR-21組裸鼠右側腋下，建立裸鼠移植瘤模型，肉眼可見皮下成瘤，即為造模成功。每周測量一次小鼠腫瘤，計算腫瘤體積，腫瘤體積(cm3)=0.5×最小表徑2×最大表徑。5周末處死小鼠，切除腫瘤并稱重。蛋白質印跡法檢測移植瘤組織中PTEN蛋白表達。

三、統計學分析

結 果

一、MiR-21抑制PTEN表達

空白對照組與陰性對照組miR-21、PTEN mRNA和蛋白表達無明顯差異(P>0.05)；與陰性對照組相比，miR-21 mimic組miR-21 mRNA表達顯著增加(P<0.05)，PTEN蛋白表達顯著降低(P<0.05)；miR-21 inhibitor組miR-21 mRNA表達顯著下降(P<0.05)，PTEN蛋白表達顯著增加(P<0.05；圖2)。由此可見，miR-21 mimic組和miR-21 inhibitor組轉染成功。

二、MiR-21可靶向負調控PTEN表達

轉染PTEN 3’-UTR MUT質粒后，miR-21 mimic組和mimic NC組PTEN螢光素酶活性無明顯差異；轉染PTEN 3’-UTR WT質粒后，miR-21 mimic組PTEN螢光素酶活性顯著低于mimic NC組(P<0.05；圖3)。

三、MiR-21促進胃癌細胞SGC-7901增殖

CCK-8實驗結果顯示，與NC組相比，miR-21組細胞增殖率顯著升高(P<0.05)，PTEN組細胞增殖率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細胞增殖率顯著升高(P<0.05；圖4)。蛋白質印跡法結果顯示，與NC組相比，miR-21組細胞Ki-67和PCNA蛋白表達顯著升高(P<0.05)；PTEN組細胞Ki-67和PCNA蛋白表達顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細胞Ki-67和PCNA蛋白表達顯著升高(P<0.05；圖5)。

四、MiR-21抑制胃癌細胞SGC-7901凋亡

TUNEL染色結果顯示，與NC組相比，miR-21組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，PTEN組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05；圖6)。蛋白質印跡法結果顯示，與NC組相比，miR-21組細胞Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05)，cleaved caspase-3表達顯著下降(P<0.05)；PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著下降(P<0.05)，cleaved caspase-3表達顯著升高(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組Bcl-2/Bax比例顯著升高(P<0.05)， cleaved caspase-3表達顯著下降(P<0.05；圖7)。

五、MiR-21促進胃癌細胞SGC-7901侵襲和遷移

Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示，與NC組相比，miR-21組細胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05)，PTEN組細胞侵襲率和遷移率顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組細胞侵襲率和遷移率顯著升高(P<0.05；圖8)。

六、MiR-21靶向PTEN促進胃癌細胞SGC-7901 PI3K/Akt的磷酸化

*與陰性對照組比較，P<0.05

*與mimic NC組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

蛋白質印跡法結果顯示，與NC組相比，miR-21組PTEN蛋白表達顯著下降(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達顯著升高(P<0.05)；PTEN組PTEN蛋白表達顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達顯著下降(P<0.05)。與PTEN組相比，miR-21+PTEN組PTEN蛋白表達顯著下降(P<0.05)，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表達顯著升高(P<0.05；圖9)。

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

七、過表達miR-21促進裸鼠移植瘤的生長

裸鼠移植瘤結果顯示，造模5周末，miR-21組裸鼠移植瘤質量顯著高于對照組[(3.67±0.82) g對(2.84±0.41) g，P<0.05]，PTEN蛋白表達明顯降低(0.27±0.06對0.56±0.10，P<0.05)。造模后第3、4、5周，miR-21組裸鼠移植瘤體積顯著大于對照組(P<0.05；圖10)。

討 論

MiRNA是一類具有調控作用的非編碼RNA，可調節靶mRNA降解或翻譯抑制，參與調控腫瘤的進展。MiR-21參與調控多種腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學行為[8]。劉夢涵等[9]的研究發現，miR-21可能通過負調控PTEN表達來抑制PI3K/Akt信號通路，調節白血病K562細胞的增殖和凋亡過程。但其在胃癌細胞中的作用機制尚不清楚。SGC-7901細胞是來源于胃癌患者淋巴結轉移灶的惡性程度較高的細胞，目前已被廣泛用于體外藥物藥效的研究，為臨床新藥開發和研究提供支持[10]。本研究對胃癌SGC-7901細胞中miR-21與PTEN之間的靶向關系進行驗證發現，miR-21可在蛋白質水平上負調控PTEN表達，但對PTEN mRNA水平無明顯影響，提示miR-21可能通過抑制PTEN的蛋白質翻譯過程，靶向負調控PTEN。PTEN是一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在維持細胞結構、調控細胞內信號轉導中具有重要作用[11]。多項研究顯示，PTEN可能通過調節機體多條重要的信號轉導通路來調節癌細胞的生物學行為[12-13]。本研究中，PTEN過表達可抑制胃癌細胞的增殖活性，miR-21和PTEN共同過表達可抵消PTEN對細胞增殖的抑制作用，提示miR-21可靶向負調控PTEN蛋白表達，促進SGC-7901細胞的增殖。本研究發現，PTEN過表達可抑制胃癌細胞中Ki-67和PCNA表達，miR-21和PTEN共同過表達可抵消PTEN的抑制作用，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，促進胃癌細胞Ki-67和PCNA表達。Ki-67和PCNA均為細胞增殖相關蛋白，其水平隨著細胞有絲分裂進程而變化，可反映腫瘤細胞的增殖活性[14]，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，調控增殖相關蛋白的表達，促進胃癌細胞增殖。

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與NC組比較，P<0.05；#與PTEN組比較，P<0.05

*與對照組比較，P<0.05

本研究中，PTEN過表達可抑制SGC-7901細胞Bcl-2/Bax比例，促進cleaved caspase-3表達，促進細胞凋亡；miR-21和PTEN共同過表達可抵消PTEN對胃癌細胞凋亡相關蛋白的調節作用，抑制胃癌細胞凋亡，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，抑制胃癌細胞凋亡。Bcl-2、Bax是一組調控線粒體膜通透性的蛋白，一旦細胞接收到外部信號刺激時，Bax會轉位至線粒體細胞膜，激活凋亡級聯反應，活化的caspase-3可啟動細胞凋亡程序[15-16]。陳華等[17]的研究顯示，PTEN可調控胃癌細胞的有絲分裂周期，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示miR-21可靶向負調控PTEN表達，抑制胃癌細胞凋亡。PTEN過表達可抑制胃癌細胞的侵襲和遷移，miR-21和PTEN共同過表達可抵消PTEN對胃癌細胞侵襲和遷移的抑制作用，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，促進胃癌細胞的侵襲和遷移。Wu等[18]的研究顯示，PTEN可調節下游Akt/mTOR表達，抑制胃癌細胞的侵襲和遷移，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，調節細胞的重要信號轉導通路，調控胃癌細胞的侵襲和遷移。

有研究表明PTEN可阻斷PI3K/Akt信號通路，抑制多種腫瘤細胞的惡性增殖[19]。PI3K/Akt信號通路可調控細胞的生長、增殖、凋亡等多種病理生理過程，是腫瘤發生和進展的關鍵信號通路[20]。PTEN的脂質磷酸酶活性可使質膜的磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化，抑制PI3K的磷酸化，阻斷下游Akt的磷酸化，進而阻斷下游激酶的活性[21]。本研究結果顯示，PTEN過表達可抑制胃癌細胞PI3K和Akt的磷酸化，miR-21和PTEN共同過表達可抵消PTEN對胃癌細胞PI3K和Akt磷酸化的抑制作用，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，促進胃癌細胞PI3K和Akt的磷酸化。Wang等[22]的研究顯示，PTEN可抑制胃癌細胞PI3K和Akt的磷酸化，參與調控胃癌細胞的增殖、侵襲和凋亡，提示miR-21可靶向負調控PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路，促進胃癌細胞增殖、侵襲，并抑制細胞凋亡。

綜上所述，miR-21可靶向負調控PTEN表達，激活PI3K/Akt信號通路，調控細胞增殖、凋亡相關蛋白的表達，促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，抑制細胞凋亡。但本研究僅初步探討了miR-21靶向負調控PTEN對胃癌SGC-7901細胞的影響，后期將進一步分析miR-21在其他胃癌細胞中的作用。