質子泵抑制劑通過下調細胞周期相關基因誘導胃癌細胞周期阻滯并促進化療增敏*

蘇 萌 張 斌 陳 敏 王 雷 徐桂芳 呂 瑛 鄒曉平&

南京醫科大學鼓樓臨床醫學院1(210008) 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化內科2

背景：研究發現質子泵抑制劑(PPI)可增強胃癌細胞的化療敏感性，抑制胃癌細胞增殖和侵襲。目的：探討PPI是否系通過影響細胞周期相關基因表達對胃癌細胞發揮化療增敏作用。方法：以不同濃度泮托拉唑處理人胃癌細胞株AGS和HGC27，CCK-8實驗檢測細胞活力，轉錄組測序結合KEGG富集分析明確PPI對胃癌細胞周期的影響，流式細胞分析、real-time PCR和蛋白質印跡法驗證細胞周期及其相關基因表達變化。利用生物信息學網站分析主要細胞周期相關差異表達基因在胃癌組織中的表達及其與患者預后的關系。CCK-8實驗檢測PPI聯合順鉑對轉染FOXM1過表達質粒或空載質粒的胃癌細胞的增殖抑制效果。結果：PPI可有效抑制胃癌細胞體外增殖。轉錄組測序和KEGG富集分析顯示經PPI處理的胃癌細胞G2/M期相關基因FOXM1、PLK1、AURKB等表達下調，并出現G2/M期阻滯，上述發現經流式細胞分析以及real-time PCR和蛋白質印跡法證實。生物信息學分析顯示上述G2/M期相關基因在胃癌組織中的表達顯著上調，并與預后不良相關。PPI聯合順鉑對胃癌細胞的增殖抑制作用顯著強于順鉑單藥處理，但可被過表達FOXM1部分逆轉。結論：PPI可通過下調細胞周期相關基因表達誘導G2/M期阻滯，從而增強胃癌細胞的化療敏感性。

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥統計中，其發病率和死亡率分居第五和第三位，包括中國在內的東亞地區胃癌發病率普遍較高[1-2]。隨著化療藥物和化療方案的不斷優化，晚期胃癌患者的生存期得以明顯延長，但中位生存期仍難以超過1年，多藥耐藥是胃癌患者預后不良的主要原因之一[3]。有效逆轉胃癌多藥耐藥、增強胃癌對化療藥物的敏感性一直是胃癌治療的難點和研究熱點。

質子泵抑制劑(proton pump inhibitors, PPIs)作為抑酸藥，是治療胃食管反流病、消化性潰瘍等酸相關疾病的首選藥物[4]，近年發現其在腫瘤治療方面也具有潛在應用價值。研究顯示PPI可通過改變細胞內外pH值、增加細胞內活性氧水平等發揮增強腫瘤細胞化療敏感性、促進腫瘤細胞凋亡等作用[5-9]。本課題組之前的研究已證實PPI預處理可增強胃癌細胞對化療藥物的敏感性，抑制胃癌細胞增殖和侵襲[10-11]。

腫瘤細胞具有快速、持續增殖的特性，活躍的細胞周期進程是其無限增殖的關鍵因素之一。影響細胞周期進程也是腫瘤化療的關鍵作用機制，很多化療藥物系通過特定靶點影響腫瘤細胞周期進程，進而抑制腫瘤細胞增殖。本研究以PPI處理人胃癌細胞株，采用體外實驗與生物信息學分析相結合的方法，探討PPI是否系通過影響細胞周期相關基因表達誘導胃癌細胞周期阻滯，從而發揮化療增敏作用，以期為闡明PPI抑制胃癌惡性生物學行為的可能作用機制提供更多理論依據。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胃癌細胞株AGS、HGC27購自中國科學院上海細胞庫，使用10% RPMI 1640培養基，培養于37 ℃、5% CO2培養箱中，經觀察細胞緊密排列、融合度達到80%～90%后進行后續實驗。

泮托拉唑鈉(Takeda GmbH)；CCK-8細胞增殖和細胞毒性檢測試劑、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；TRIzol RNA分離試劑、Lipofect-amineTM3000轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)；NEBNext?UltraTMⅡ RNA Library Prep Kit for Illu-mina?(New England Biolabs.)；細胞周期檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司)；RIPA裂解液、蛋白質定量試劑盒(碧云天生物)；兔抗人叉頭框蛋白M1(forkhead box M1, FOXM1)單克隆抗體、鼠抗人Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1, PLK1)單克隆抗體、兔抗人Aurora激酶B(Aurora kinase B, AURKB)單克隆抗體、HRP標記抗小鼠、抗兔IgG(Cell Signaling Technology, Inc.)；兔抗人周期蛋白B1(cyclin B1, CCNB1)單克隆抗體、兔抗人周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1, CDK1)單克隆抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich, Merck KGaA)； pcDNA3.1-HA-FOXM1過表達質粒為南京醫科大學鼓樓臨床醫學院實驗室保存。

二、方法

1. CCK-8實驗：將2株胃癌細胞消化成細胞懸液，以每孔3 000細胞/100 μL接種于96孔板，24 h后加入不同濃度泮托拉唑，繼續培養48 h。每一處理組設6個復孔，同時設置不予PPI處理的對照組和無細胞空白組。處理結束后棄去完全培養基，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清培養基，孵育1～2 h。以酶標儀測定各孔450 nm處吸光度值(A值)，計算細胞相對活力。細胞相對活力=(處理組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2. 轉錄組測序：培養于6孔板中的AGS、HGC27細胞分別以含相應濃度泮托拉唑或不含泮托拉唑的完全培養基處理48 h，PBS洗滌3次，室溫下TRIzol試劑提取總RNA。每一樣品使用3 mg RNA作為RNA樣品制備的輸入材料，使用NEBNext?UltraTMⅡ RNA Library Prep Kit for Illumina?生成測序文庫，庫檢合格后上機測序并行KEGG通路富集分析，篩選有顯著意義的信號通路。

3. 細胞周期檢測：收集經泮托拉唑處理48 h的胃癌細胞，同時設置不予PPI處理的對照組，根據試劑盒說明書進行操作，75%乙醇固定2 h，1 500×g離心5 min，棄去上清液，PI染色，37 ℃避光溫浴30 min，上流式細胞儀檢測。

4. 質粒轉染和化療藥物干預：轉染前一天將胃癌細胞在6孔板中鋪板，鋪板數量以24 h后細胞密度達到50%～70%為宜。根據試劑說明書進行操作，分別轉染FOXM1過表達質粒pcDNA3.1-HA-FOXM1和空載質粒，24～72 h后更換新鮮完全培養基繼續培養，用于后續實驗。

將質粒轉染后的胃癌細胞制成懸液，以每孔3 000細胞/100 μL接種于96孔板，予2 μmol/L順鉑(cisplatin, DDP)單藥或40 μg/mL PPI+2 μmol/L DDP聯合處理48 h，同時設置不予PPI處理的對照組和無細胞空白組，CCK-8實驗檢測細胞活力。

5. Real-time PCR：TRIzol試劑提取各組胃癌細胞總RNA，超微量光度計測定RNA濃度和質量，配置20 μL逆轉錄體系，將RNA逆轉錄為cDNA，行real-time PCR擴增，操作均按試劑說明書進行，目的基因PCR引物序列見表1。2-△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 Real-time PCR引物序列

6. 蛋白質印跡法：將RIPA裂解液、PMSF(100×)、蛋白酶抑制劑混合物(25×)以95∶1∶4的比例配制蛋白完全裂解液裂解各組胃癌細胞，低溫高速離心10 min，取上清液，BCA法定量，高溫變性樣品蛋白。蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳(90 V 30 min, 120 V 60 min)，預冷轉膜緩沖液中200 mA 120 min轉膜，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，剪膜，4 ℃孵育一抗超過8 h，洗膜后室溫孵育二抗2 h，洗膜后顯影、定影。

7. 生物信息學分析：利用基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)和Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)行細胞周期G2/M期相關基因表達水平分析和預后分析。

三、統計學分析

結 果

一、PPI抑制胃癌細胞增殖

CCK-8實驗結果顯示，AGS、HGC27細胞經PPI(>50 μg/mL)處理48 h后，細胞活力顯著受抑，PPI抑制2株胃癌細胞的50%最低抑菌濃度(IC50)分別為127 μg/mL和88 μg/mL(圖1)，表明PPI可有效抑制胃癌細胞體外增殖。

二、PPI對胃癌細胞基因表達的調控

根據相應IC50值，分別以100 μg/mL和80 μg/mL PPI處理AGS和HGC27細胞，48 h后行轉錄組測序。AGS細胞中有9 959個基因表達發生變化，其中4 886個基因表達上調，5 073個基因表達下調；HGC27細胞有11 811個基因表達發生變化，其中5 726個基因表達上調，6 085個基因表達下調(圖2A)。對2株胃癌細胞的差異表達基因取交集，KEGG通路富集分析顯示細胞周期相關通路(調控細胞周期G2/M期轉變、DNA復制、染色體分離等)變化最為顯著(圖2B)。

三、PPI通過調控細胞周期相關基因表達誘導胃癌細胞G2/M期阻滯

流式細胞分析顯示，AGS、HGC27細胞分別經100 μg/mL和80 μg/mL PPI處理48 h后，均發生明顯的G2/M期阻滯(P均<0.05；圖3A)。對轉錄組測序數據進行分析，發現G2/M期相關基因FOXM1、PLK1、AURKB、CCNB1、CDK1表達水平均有不同程度的下調。以real-time PCR和蛋白質印跡法進行驗證，結果證實上述基因在AGS、HGC27細胞中的表達可被PPI顯著抑制(P均<0.05；圖3B、3C)，表明PPI可通過抑制細胞周期相關基因表達誘導胃癌細胞G2/M期阻滯。

四、G2/M期相關基因在胃癌中的表達及其與預后的關系

利用GEPIA數據庫提取癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數據庫STAD(stomach adenocarcinoma)隊列中的胃癌組織基因表達數據(n=408)和TCGA、基因型-組織表達數據庫(Geno-type-Tissue Expression, GTEx)中的正常胃上皮組織基因表達數據(n=211)。與正常胃上皮組織相比，胃癌組織中G2/M期相關基因FOXM1、PLK1、AURKB表達均明顯上調，差異有統計學意義(P均<0.05；圖4A)。

利用Kaplan-Meier Plotter分析FOXM1、PLK1、AURKB基因表達與胃癌患者預后的關系，總生存期(overall survival, OS)和無進展生存期(progression-free survival, PFS)分析分別納入875例和640例胃癌患者，結果顯示，除FOXM1高、低表達組間OS無明顯差異外，上述基因高表達者預后均明顯差于低表達者，差異有統計學意義(P均<0.05；圖4B)。

圖1 PPI處理48 h后胃癌細胞相對活力(CCK-8實驗)

A：AGS、HGC27細胞經PPI處理后轉錄組測序火山圖；B：2株胃癌細胞差異表達基因取交集后KEGG通路富集分析氣泡圖

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1; ns, P>0.05

五、過表達FOXM1逆轉PPI對胃癌細胞的化療增敏作用

AGS、HGC27細胞轉染FOXM1過表達質粒3 d后，以蛋白質印跡法驗證轉染效率，結果顯示與轉染空載質粒的對照組相比，轉染FOXM1過表達質粒的胃癌細胞中FOXM1蛋白表達明顯上調(圖5A)。

轉染空載質粒和FOXM1過表達質粒的胃癌細胞經2 μmol/L DDP單藥或40 μg/mL PPI+2 μmol/L DDP聯合處理48 h后，CCK-8實驗結果顯示，與DDP單藥處理相比，PPI+DDP聯合處理對胃癌細胞活力的抑制作用更為顯著，而過表達FOXM1基因可部分逆轉此種增殖抑制作用(圖5B)，表明過表達FOXM1能逆轉PPI對胃癌細胞的化療增敏作用。

兩組間比較，*P<0.05

兩組間比較，**P<0.01，***P<0.001

討 論

胃癌是一個全球性的健康問題，全世界每年有100余萬人被新診斷為胃癌。在過去50年中，盡管胃癌發病率和死亡率在全球范圍內有所下降，但在世界大部分地區，胃癌仍然保持著75%的高病死率[12]。

近年來，有關PPI抑制腫瘤發生、發展的文獻陸續發表。研究顯示PPI預處理可通過抑制液泡-H+-ATP酶(vacuolar-H+-ATPase, V-H+-ATP酶)表達和活性、提高細胞外和溶酶體細胞器pH值、增加化療藥物在胞質內的停留時間、抑制自噬等機制提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[6,13-15]；此外，PPI還可通過影響游離脂肪酸合成抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[16]。在幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)相關胃癌中，PPI可通過抑制MAPK ERK1/2信號通路抑制Hp介導的腫瘤血管生成[17]。

本課題組前期也針對PPI抑制胃癌進行了一系列研究，相繼證明PPI可通過影響胃癌中低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達和分布抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[18]；PPI可靶向STAT3、V-H+-ATP酶/mTOR/HIF-1α、Akt/GSK-3β/β-catenin等信號通路以及通過逆轉上皮-間質轉化(EMT)提高胃癌的化療敏感性[10,19-20]；PPI還可通過STAT3依賴的方式調節端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因啟動子區活性以抑制其表達，進而抑制胃癌細胞侵襲[11]。但迄今尚未就PPI對胃癌細胞周期的影響進行深入研究。

細胞周期阻滯是抑制腫瘤細胞增殖的關鍵策略之一，尋找并抑制其中的關鍵靶點有助于為腫瘤治療和預防提供新思路。本研究利用轉錄組測序技術篩選經PPI處理的胃癌細胞的差異表達基因，發現調控細胞周期G2/M期的關鍵基因FOXM1、PLK1、AURKB、CCNB1、CDK1表達受抑，且對差異表達基因的KEGG富集分析也提示PPI處理可誘導胃癌細胞G2/M期阻滯。CCNB1和CDK1是參與促進腫瘤細胞周期進程的關鍵蛋白已為大量研究所確認。PLK1參與有絲分裂和胞質分裂的各個環節，在細胞周期G2/M期進程中發揮關鍵作用。AURKB可通過磷酸化PLK1介導染色體的精確分離[21-22]。FOXM1可通過促進G2/M期轉變促進細胞有絲分裂進程[23-24]。本研究流式細胞分析證實PPI可誘導胃癌細胞發生G2/M期阻滯，應用real-time PCR和蛋白質印跡法對轉錄組測序差異表達譜進行驗證，也證實了PPI作用于胃癌細胞可顯著抑制上述調控G2/M期進程的重要分子表達。進一步的生物信息學分析提示胃癌組織中FOXM1、PLK1、AURKB基因表達顯著高于正常胃上皮組織，且其高表達與預后不良顯著相關。綜合上述研究發現，FOXM1、PLK1、AURKB可能是PPI誘導胃癌細胞發生G2/M期阻滯，進而抑制胃癌進展的關鍵靶點。既往研究顯示抑制PLK1、AURKB表達可抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，提高胃癌細胞對DDP的化療敏感性[25-26]，但未見抑制FOXM1是否會影響DDP對胃癌化療效果的報道。為此，本研究對抑制FOXM1的化療增敏作用進行了驗證，結果顯示過表達FOXM1可部分逆轉PPI聯合DDP對胃癌細胞增殖活性的抑制作用，表明PPI可通過抑制FOXM1表達增強其化療敏感性。

綜上所述，細胞周期相關基因FOXM1、PLK1、AURKB等在胃癌細胞中高表達并與預后不良相關；PPI可通過下調上述細胞周期相關基因表達誘導胃癌細胞發生G2/M期阻滯，從而增強胃癌細胞的化療敏感性。PPI作為臨床常用藥物，具有較好的安全性[27]，因此有望作為一種新的胃癌化療增敏藥物在胃癌臨床治療中發揮作用。本研究結果為PPI抑制胃癌惡性生物學行為的研究積累了更多的理論依據。