芹菜葉斑病病原菌的分離鑒定、生物學特性及其生防菌篩選

張建強，吳康莉，張曉夢，李佳佳，Abdramane Salah Zene，漆永紅，沈 彤,，田永強,

(1.蘭州交通大學 化學與生物工程學院，蘭州 730070；2.蘭州交通大學研究院，蘭州 730070；3.甘肅省農業科學院 植物保護研究所，蘭州 730070)

芹菜(Apiumgraveolens)屬傘形科芹屬植物，因耐低溫是西部地區高原夏菜主要蔬菜栽培品種。近年來，定西市安定區高原夏菜發展迅速，芹菜是最主要的栽培品種之一[1]。因芹菜市場需求大，種植面積逐年增大和連作種植導致病蟲害高發，尤其芹菜葉斑病是主要防治的病害之一，發病普遍，，一旦發生往往蔓延較快，從而給芹菜種植業造成嚴重損失。據文獻記載，芹菜上發生的葉斑病主要有鏈格孢葉斑病(Alternariaspp.)[2-3]、尾孢葉斑病(Cercosporaapii)[4]、灰霉腐爛病(Botrytiscinerea)、菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)、葉點霉葉斑病(Phyllostictaapii)[5-6]、斑枯病(Septoriaapiicola)[7]、細菌葉斑病(Pseudomonascichorii)[5]及細菌葉枯病(P.viridiflava)等[8]。在不同地區或不同品種上，芹菜病害發生種類和嚴重程度存在差異。

甘肅省定西市芹菜葉斑病發生比較普遍，但沒有對其病原菌開展分離鑒定、生物學特性、藥劑篩選和生物防治方面的深入研究工作，導致用藥不科學，防治效果不佳，給農戶造成極大的損失。對該病生物防治方面也未見報道。本試驗通過芹菜葉斑病病原菌的分離和鑒定、生物學特性及生物防治藥劑的篩選研究，以期進一步明確芹菜葉斑病的病原菌、病原菌生物學特性并篩選出生物防治菌劑，為該病害的大田防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集 2019年9月在甘肅省定西市安定區內官營鎮(經度為104°24′41.9″，緯度為35°30′51.3″)蔬菜栽培地采集典型染病芹菜(品種為‘皇妃芹菜’)葉片，共采集10份樣品。

1.1.2 供試生防菌株 選用蘭州交通大學微生物實驗室保藏的5株生防菌株，即蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus(4-2-1)、貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis(F3A)、甲基營養型芽孢桿菌B.methylotrophicus(9-2-1)、解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(SL1)、熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens(YG)。采用平板對峙培養法進行拮抗篩選試驗。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用常規組織分離法[9]進行病菌的分離，切取葉片病健交界處 3～4 mm×2～3 mm的組織，在70%的酒精中消毒5秒后用無菌水清洗3次，用滅菌濾紙拭干，接種于PDA培養基，在25 ℃培養箱培養約7 d時，產生孢子后進行單孢分離和純化培養[10-11]，將純化好的菌種轉接PDA斜面保存。

1.2.2 病原菌的致病性測定 根據柯赫氏法則，進行致病性測定。在菌落邊緣用直徑4 mm的打孔器打取菌餅，選取10葉齡皇妃芹菜葉片經酒精消毒和無菌針刺后，將菌餅貼于葉片的刺傷部位，每個菌株作3次重復接種，以刺傷但不接菌餅為空白對照。將接種后葉片置于已滅菌且底部加有濕濾紙片的平板25 ℃保濕培養，每天觀察發病情況。5 d后對發病的葉片進行病菌的再分離培養，觀察是否為同一種真菌侵染。

1.2.3 病原菌的形態鑒定 將致病菌接種在PDA平板上，在25 ℃培養箱中培養6 d后觀察菌落特征，待產孢后，在顯微鏡下觀察分生孢子形態特征。

1.2.4 病原菌的基因序列分析 DNA提取使用試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，刮取平板上新鮮菌絲體提取基因組DNA，分別選用ITS、GAPDH、TEF1、RPB2、Altal、endoPG和OPA10-2等引物(表1)進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，PCR擴增的反應參數：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增產物送深圳華大基因公司測序，測序結果提交GenBank，用BLAST進行比對分析，利用MEGA 6.0軟件Neighbor Joining方法進行聚類，選擇1 000個重復作Bootstrap值分析建立系統發育樹。

1.3 病原菌生物學特性

1.3.1 碳氮源對病菌菌絲體生長的影響 以查氏培養基為基礎培養基(蔗糖30 g/L、瓊脂20 g/L、NaNO32 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4· 7H2O 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L)，分別用等質量的葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、玉米粉替換基礎培養基中的碳源；分別用等質量的牛肉膏、蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、酵母浸粉替換基礎培養基中的氮源，分別配制成不同碳源、氮源培養基，接菌后置于25 ℃恒溫培養箱中，于7 d后利用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理作5次重復[17]。

1.3.2 溫度、pH對病菌菌絲體生長的影響 設置培養基pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5共16個不同的梯度，將病原菌接種于不同pH的PDA平板上，于25 ℃恒溫培養。設置溫度為5、10、15、20、25、30、35 和 40 ℃ 8個溫度梯度，病原菌接種于PDA平板上培養。7 d后利用十字交叉法測量不同pH和不同溫度條件下的菌落直徑，每個處理作 5 次重復[18]。

1.3.3 病原菌分生孢子萌發時間的測定 采用瓊脂培養法[19]，做一定改進，取滅菌載玻片，在滅菌冷卻至約45 ℃的1.5%水瓊脂培養基中沾一下，待水瓊脂凝成薄層后，去掉一面水瓊脂培養基，將有瓊脂培養基的面朝上，置于培養皿中的“U”形玻棒，吸取10 μL孢子數為1.5×106的病菌孢子懸浮液均勻涂抹在水瓊脂平板上，部加浸水的濾紙片保濕，置于25 ℃培養，分別在2、4、6、8、10、12、14和16 h時鏡檢孢子萌發率。每個處理重復3次。

1.3.4 溫度、濕度、pH對病原菌分生孢子萌發的影響 配制1.5%水瓊脂培養基，將pH調節為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0共8個梯度；溫度設置5、10、15、20、25、30、35 和 40 ℃共8個梯度；濕度采用張佳星等[20]的方法，每個處理重復3次。孢子萌發保濕培養10 h后鏡檢，測定不同溫度、濕度和pH條件下的孢子萌發率。

1.3.5 光照對病菌菌絲體生長的影響 將菌餅接種于PDA平板上，分別設置全光照、全黑暗和光暗交替 (12L/12D)3個處理，25 ℃恒溫培養， 5 d后測量菌落直徑，比較不同光照處理對菌絲體生長的影響，每個處理作3次重復。

1.3.6 光照對病菌孢子萌發的影響 將10 μL孢子數1.5×106的病菌孢子懸浮液涂布于水瓊脂平板，設置全光照、全黑暗和光暗交替(12L/12D)3個處理，置于25 ℃保濕培養，10 h后鏡檢萌發率，每個處理作3次重復。

1.3.7 病原菌菌絲體與孢子致死溫度的測定 將病原菌菌餅和孢子數為1.5×106的孢子懸浮液分別于50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃4個溫度下水浴處理10 min，迅速冷卻至25 ℃培養。10 h后鏡檢孢子萌發情況， 2 d后觀察菌落生長情況。每個處理3次重復。

表1 研究中所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.4 生防菌抑菌活性測定

采用平板對峙培養法[21]。用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，接種于PDA平板中央。同時在其夾角呈90°的四周、間距靶標病菌3.0 cm處分別接種5種生防菌(菌株4-2-1、菌株F3A、菌株9-2-1、菌株SL1、菌株YG)，25 ℃恒溫培養6 d后測定病菌菌落直徑，并計算生長抑制率，每個處理3個重復。并挑取抑菌率最高的平板病菌菌落邊緣，用顯微鏡觀察菌絲形態的變化。

抑制率=(對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%

1.5 數據處理

利用Excel2003和SPSS 19.0軟件對試驗數據進行統計分析和Origin8.0軟件作圖，并應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 田間發病癥狀和發生情況

本試驗調查了甘肅省定西市安定區芹菜葉斑病害，一般從老葉葉背開始發病，嚴重時幼葉發病，高溫高濕的環境有利于發病。最初的葉片癥狀是許多淺棕色小斑點，圓形或不規則形，病癥后期病斑會逐漸增多，并且多個病斑相互匯合成不規則形的大褐色病斑，嚴重時整片葉片發黃，枯萎死亡。該病害發生嚴重時感染芹菜莖部，與葉片癥狀一致(圖1)。該病害發生比較普遍，發生率為25% ～ 45%，且傳播速度快，給當地芹菜生產造成很大的經濟損失。

2.2 病原菌的分離和致病性測定結果

通過常規分離法得到1株真菌Q1。依據柯赫氏法則開展回接試驗，發現刺傷接種24 h后可在葉片上出現水漬狀淺褐色小斑點，后發展成近圓形或不規則形壞死病斑，病斑呈黃褐色至深褐色，邊緣清晰，并著生少量灰色菌絲，隨后逐漸擴大成褐色典型病斑。7 d后芹菜葉片上的褐色病斑逐漸擴大并壞死，而對照組均未發病(圖1)。對人工接種發病組織再次病菌分離，成功獲得了原分離病菌Q1，證明該菌株為芹菜葉斑病的 病原。

2.3 病原菌形態學特征和分子生物學鑒定

2.3.1 病原菌形態特征 病原菌在PDA平板生長6 d時，菌落直徑為8 cm，菌落初呈墨綠色，后呈黑灰色，中央灰白色邊緣為灰橄欖色，菌絲濃密，絨毛狀；菌絲無色，有隔；分生孢子梗直或彎曲，少有分支；分生孢子單生或短鏈生，倒棍棒狀或卵形，黃褐色至青褐色，具橫膈膜3～7個，縱、斜膈膜1～3個，孢子長20.0～50.0 μm，寬 3.5～14.0 μm，并參照文獻進行形態鑒定[22-27]，確定菌株Q1為細極鏈格孢(A.tenuissima) (圖2)。

2.3.2 病原菌的基因序列分析 利用ITS、GAPDH、TEF1、RPB2、Altal、endoPG、OPA10-2等7個基因擴增和測序，在NCBI進行 BLAST比對分析，該菌屬于Alternaria屬，將基因序列提交GenBank獲得登錄號分別為：MN046364，MW016006，MW016001， MW016002，MW016 003，MW016004，MW016005。參照 Weir等[28]的研究方法，從GenBank中選取21個菌株的序列作為參照序列，利用7個基因序列，結合鏈格孢菌屬其他同屬菌株，以鄰接法共同構建系統發育樹(圖3)。該系統發育樹中菌株Q1的ITS基因與細極鏈格孢(A.tenuissima)和交鏈鏈格孢(A.alternata)聚在一個獨立進化分支，同源性相近，無法將其區分。而菌株Q1的GAPDH、TEF1、Altal、OPA10-2和endoPG 5段基因均與細極鏈格孢(A.tenuissima)在系統發育樹上聚在一起。并參考楊麗萍等[29],Zhao等[26]運用多基因鑒定細極鏈格孢的分析方法，最終確定菌株Q1為細極鏈格孢(A.tenuissima)。

2.4 病原菌生物學特性

2.4.1 碳、氮源對病菌菌絲體生長的影響 碳、氮源對病菌菌絲體生長有影響(圖4)，玉米粉為碳源的培養基生長最快，菌絲體生長濃密，7 d菌落直徑達8.5 cm；其他培養基的利用相對較低。該菌在以硝酸鉀為氮源的培養基上生長最快，7 d時菌落直徑達6.0 cm，但菌落比較稀疏；蛋白胨次之，7 d時菌落直徑達5.6 cm，菌落較厚；其他培養基的利用率較低，菌絲體生長緩慢。

2.4.2 溫度、pH對菌絲體生長的影響 不同溫度和pH處理對病原菌菌絲體生長的影響存在差異(圖5)。該菌在5～40 ℃均可生長，其中25 ℃生長最快，7 d菌落直徑達8.4 cm。該病菌在pH 5～12.5之間均可生長，pH 7.5時菌絲體生長 最快。

2.4.3 病原菌分生孢子的萌發率 結果如表2所示，處理2 h病菌孢子開始萌發產生芽管，6 h時孢子大量萌發，芽管不斷伸長；而16 h萌發率達到最高，達98.6%。

表2 病原菌孢子在不同時間的萌發率Table 2 Germination rate of pathogen spores at different time

2.4.4 溫度、濕度、pH對病原菌分生孢子萌發的影響 在處理10 h時鏡檢，病菌分生孢子在 5～35 ℃之間的萌發率均達18.6%以上，在10 ℃以上隨溫度增加，其萌發率顯著增加，最佳萌發溫度為25 ℃，萌發率達94.6%，但在40 ℃時其孢子萌發率顯著下降6%。病原菌孢子在pH4-12范圍內均可萌發，但在pH 7時萌發率達90.6%；在相對濕度為100%和自由水條件下萌發率分別為96.5%和98.1%,與其他處理存在顯著差異(圖6)。

2.4.5 光照對病原菌菌絲體生長和孢子萌發的影響 連續光照、光暗交替和連續黑暗條件下病菌菌絲體生長存在顯著性差異(表3)。在連續光照條件下菌絲體生長最好，4 d菌落直徑達5.5 cm；而在連續黑暗條件下菌絲體生長最差。分生孢子在全光照、光暗交替及全黑暗條件下差異不顯著，表明光照對分生孢子的萌發無顯著影響。

表3 光照對病菌菌絲體生長和孢子萌發率的影響Table 3 Effects of light on mycelium growth and spore germination rate

2.4.6 病原菌菌絲體及孢子致死溫度的測定 菌株Q1培養2 d觀察，在50 ℃水浴處理10 min后菌絲仍可生長，在55 ℃及更高溫度處理后不再生長，表明該菌致死溫度為55 ℃ 10 min。分生孢子在50 ℃水浴處理10 min后仍能萌發，但在55 ℃及其以上溫度處理10 min則不再萌發,結果表明分生孢子的致死溫度為 55 ℃ 10 min。

2.5 生防菌抑菌篩選

以5種生防菌(菌株4-2-1、菌株F3A、菌株9-2-1、菌株SL1、菌株YG)對芹菜葉斑病菌作對峙培養(圖7)。6 d后發現5種供試菌均對該病菌具有抑菌活性(表4)，其中解淀粉芽孢桿菌SL1抑菌率最高，達到69.80%。與對照組相比，病菌生長受抑制后菌絲膨大變粗或者皺縮變細，分枝增多，節間縮短，出現囊泡狀畸形，并伴有細胞壁破裂等現象(圖8)，表明供試生防菌可產生抑菌活性物質。

表4 供試生防菌對病菌菌絲體生長的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of biocontrol bacteria on the growth of mycelium

3 結論與討論

芹菜葉斑病是芹菜生產中普遍發生的一種主要病害，在澳大利亞、加拿大、巴西、古巴、幾內亞、丹麥和意大利等均有報道。我國對芹菜鏈格孢葉斑病缺乏深入調查研究，本試驗明確了該病害的田間侵染部位和發病癥狀，以老葉先發病，病斑多散生，大小不等，直徑0.2～0.8cm，深褐色，邊緣清晰，病斑中間有稀疏霉層，且易開裂；保濕培養易產生大量倒棍棒狀的分生孢子。近年來，隨著甘肅省芹菜種植面積的不斷增加，芹菜葉斑病的發生呈逐漸加重趨勢，研究葉斑病病原菌的生物學特性和生物防治具有中藥意義。

明確病害的病原是研究其發生規律和制定有效防治措施的前提。據報道，鏈格孢菌是常見的植物葉斑類病害的主要病原菌[30]，王瑩瑩等[31]對中國14個省份蔬菜主產區的病害調查發現，8個種的鏈格孢菌可侵染茄科、葫蘆科、十字花科和百合科的32種寄主植物。張天宇在芹菜上描述A.burnsii，但指出依其形態應屬于A.tenuissima群。報道稱芹菜上發生的葉斑病主要有鏈格孢葉斑病(Alternariaspp.)[32]，該報道確定了芹菜葉斑病病菌為鏈格孢屬，僅依據形態特征確定為巴恩斯鏈格孢(A.burnsii)，但沒有開展分子生物學鑒定和病原生物學特性研究。本研究通過病原菌形態學特征和多基因分子序列鑒定，首次明確了引起甘肅省定西市芹菜葉斑病害的病原為細極鏈格孢(A.tenuissima)，因此，將該病害稱為芹菜鏈孢菌葉斑病。

病原菌生物學特性的研究為防治藥劑的篩選和田間管理提供理論依據。本研究通過對芹菜鏈格孢葉斑病菌生物學特性的研究，發現該病菌菌絲體生長和孢子萌發的最適溫度均為25 ℃，pH為中性、環境高濕時有利于菌絲體生長和孢子萌發。該病菌可利用多種碳氮源，但以玉米粉和硝酸鉀為最佳碳源和氮源。光照更有利于菌絲體生長，但對孢子萌發無顯著影響，菌絲和孢子的致死溫度均為55 ℃處理10 min。這些特性說明芹菜鏈孢菌葉斑病在低溫高濕易發病，與文獻田間調查結果一致，在芹菜栽培期7-8月份易發病，特別是20～30 ℃，高溫多雨、露水或澆水頻繁時易侵染。因此，這個階段也是防治葉斑病的關鍵時期[33-35]。

目前，芹菜生產上對葉斑病的防治主要以化學藥劑為主，但過量施用化學藥劑可造成抗藥性增加、農產品農藥殘留和水土污染等食品安全和環境污染問題，基于蔬菜對農藥要求的特殊性，篩選利用高效和環境友好的生防菌可有效解決化學農藥帶來的弊端。利用枯草芽孢桿菌防治三葉木通葉斑病(A.tenuissima)可顯著抑制病害發生[35]，俞家楠等[36]研究表明環狀芽孢桿菌對銀杏葉斑病細極鏈格孢的抑菌效果較好,抑菌率高達 80.88%。本研究通過生防菌株拮抗篩選，發現蠟樣芽胞桿菌4-2-1、貝萊斯芽孢桿菌F3A、甲基營養型芽孢桿菌9-2-1、解淀粉芽孢桿菌SL1、熒光假單胞菌YG等5種生防菌均對芹菜葉斑病害的病原細極鏈格孢具有較好的生防效果，其中解淀粉芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌率達到69.80%，具有開發生物防治菌劑的潛力。關于解淀粉芽孢桿菌對芹菜葉斑病的田間防治效果有待于進一步研究。