甜蕎 FeTCP1基因克隆及脅迫誘導表達分析

朱旭東，熊澤浩，徐 銳，曹 艷，侯澤豪，方正武

(長江大學 農學院/主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，湖北荊州 434025)

TCP是調控植物發育的特異性因子，具有一個非典型的約59個氨基酸的bHLH保守結構域[1]。目前，已知TCP家族的成員可分為PCF亞家族和CIN和CYC/TB1亞家族[2]。PCF亞家族大部分成員的蛋白序列較短，基序組成較為保守，調控基因正向表達；CIN和CYC/TB1亞家族的成員存在一個富含精氨酸的基序(18～20個氨基酸)稱為R結構域，主要包含調控植物側生器官生長和形態發育的基因[3-4]。PCF亞家族成員主要介導細胞生長和分裂的顯著刺激，CIN和CYC/TB1亞家族成員則協同抑制細胞生長和分裂[5]。

TCP家族廣泛參與調控植物生長、發育、非生物脅迫以及激素反應等，與植物器官形態性狀的進化密切相關，控制著花的對稱性及葉的性狀表型[6]，還參與植株內激素信號的轉導[7]。在番茄(Solanumlycopersicum)[8-10]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5,11-13]、玉米(Zeamays)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]等植物中證實TCP基因在植物逆境應答方面發揮著作用。在擬南芥中AtTCP11通過上調VND7基因的表達量，來引起維管束發育的缺陷；AtTCP3、AtTCP15也是通過調控生長素來響應相關的表達[12]；AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17主要通過依賴和不依賴PITS兩個途徑來促進生長素的合成[4]。水稻的OsPCF2、OsPCF5、OsPCF6均涉及干旱和冷脅迫的耐受性[15]。

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)是蓼科蕎麥屬植物，具有較強的抗逆能力。目前關于TCP家族成員在甜蕎中的研究相對較少。本研究以抗旱品種‘西農9976’為試驗驗材料，利用同源克隆方法得到FeTCP1基因的CDS序列，運用生物信息學方法對FeTCP1基因序列和編碼蛋白序列進行分析和鑒定，利用系統進化樹分析不同物種間TCP1蛋白的親緣關系。同時在逆境脅迫下對FeTCP1基因在甜蕎幼苗的轉錄表達進行實時熒光定量分析。結合蛋白序列和實時熒光定量分析來預測TCP1基因在甜蕎中的表達模式。為TCP1基因在逆境脅迫下的功能分析提供理論基礎，將有助于進一步研究TCP基因家族的進化關系和分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為甜蕎品種‘西農9976’。篩選均一飽滿的蕎麥種子，經0.1% HgCl 消毒5 min 后，用無菌水洗凈，置于培養皿中，25 ℃催芽。待根長生長到2 cm 左右時，將發芽一致的甜蕎種子移栽至水培盒，置于人工氣候箱中培養，培養條件為：25 ℃ 12 h光照，20 ℃ 12 h黑暗；相對濕度恒定為60%。待培養7 d至甜蕎幼苗子葉完全展開時，分別利用15% PEG 6000和0.1% NaCl溶液對甜蕎幼苗進行脅迫處理，以處理0 h為對照，設3個生物學重復。分別于脅迫后3 h、6 h、 12 h、24 h和48 h對甜蕎幼苗的子葉和根部進行樣品采集，液氮速凍后，置于-80 ℃保存，備用。

1.2 FeTCP1基因的克隆

利用RNA試劑盒(RN38)提甜蕎幼苗葉片和根部的總RNA，利用反轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，根據長江大學耐漬麥類種質資源實驗室前期轉錄組學測序得到的cDNA序列，利用NCBI進行Primer Blast設計特異性引物，PCR擴增出FeTCP1序列。具體引物信息見表1。引物合成和DNA測序均由北京擎科生物公司完成。

表1 引物名稱與序列Table 1 Primer name and sequence

1.3 FeTCP1基因生物信息學分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定FeTCP1基因開放式閱讀框(ORF)和氨基酸數目；利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預測FeTCP1的氨基酸長度、分子質量(MW)；利用軟件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)預測FeTCP1蛋白二級結構；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預測蛋白質三級結構；利用NCBI進行Protein Blast搜索同源序列，篩選雙子葉植物中的同源序列，用MEGA 7.0構建系統進化樹，確定FeTCP1在各物種間的演化關系。

1.4 FeTCP1基因在干旱和鹽脅迫下的表達 分析

在甜蕎幼苗脅迫處理后分別提取其葉片和根部的總RNA，去除殘留的DNA后檢測其質量與完整性，利用cDNA進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，檢測FeTCP1基因在脅迫誘導下的表達模式。使用Primer進行特異性引物設計，上、下游特異性引物分別為QFeTCP-RTF和 Q FeTCP-RTR(表 1)；qRT-PCR檢測所用的陽性對照內參基因為甜蕎的ACTIN基因(Genbank登錄:HQ398855.1)，檢測特異性引物分別為QFeACTIN-F 和QFeACTIN-R(表1)。采用兩步法PCR擴增程序，使用2-ΔΔCt法計算表達量，用SPSS 19.0 對數據進行顯著性分析，用Microsoft excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 甜蕎 FeTCP1基因的克隆

利用引物FeTCP1-F/FeTCP1-R對甜蕎品種‘西農9976’的cDNA進行擴增，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗，獲得1條1 800 bp左右的PCR產物(圖 1)。將目的條帶回收純化后，經連接、轉化，篩選陽性克隆進行測序。利用NCBI在線分析序列，開放式閱讀框(ORF)為1 623 bp，編碼540個氨基酸。進行Blast同源性搜索，結果與茶樹CsTCP1(XM_028267645.1)的同源性高達98%，將其命名為FeTCP1，GenBank登錄:MW092108。

2.2 FeTCP1基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1FeTCP1基因編碼蛋白的理化性質預測 利用ExPASy預測 FeTCP1蛋白的理化性質。結果表明， FeTCP1蛋白的分子式為C2563H4256N716O797S24，分子質量為58 623.75 ku，等電點為5.97，屬于弱酸性蛋白。疏水性總平均為-0.032，不穩定系數為32.67，屬于親水性穩定蛋白。在第96個氨基酸處疏水性最強，峰值達到2.756；在第264個氨基酸處的親水性最強，峰值達到-2.289。

2.2.2FeTCP1基因編碼蛋白的亞細胞定位及保守結構域 利用WOLF PSORT進行亞細胞定位，結果FeTCP1蛋白定位于細胞質中，沒有分泌通道信號肽。利用NCBI/CD Search分析FeTCP1蛋白保守結構域。其含有一個TCP1_alpha的保守結構域，屬于TCP-1家族、α亞單位。

2.2.3 FeTCP1蛋白的氨基酸序列比對及進化分析 利用DNAMAN 將FeTCP1蛋白的氨基酸序列與芝麻(SiTCP1)、木薯(MeTCP1)、橡膠樹(HbTCP1)和獼猴桃(AcTCP1)的TCP1氨基酸序列進行多重比對分析(圖 2)。結果表明，5個雙子葉植物間的蛋白氨基酸長度基本一致，同源性達96.04%，表明TCP1在這幾個物種中存在較高的保守性。

將FeTCP1蛋白序列在NCBI數據庫中進行Protein Blast搜索，篩選40個雙子葉植物蛋白序列，用MEGA7.0構建系統進化樹(圖3)。顯示甜蕎的FeTCP1與甜菜(XM_010683900.2)、睡蓮(XM_031646224.1)和罌粟(XM_026525527.1)親緣關系最近，其中甜菜同為藜科植物。而另一種蓼科植物烏草(XM_021424703.1)與 FeTCP1的親緣關系則相對較遠。與FeTCP1親緣關系相對最遠的是苦瓜(XM_022288799.1)。這些親緣關系符合植物形態學分類及進化規律。TCP1基因在甜蕎與甜菜中的較高同源性，推測FeTCP1基因在雙子葉藜科植物中存在著較高的保守性。

2.2.4 FeTCP1蛋白的二級、三級結構預測 利用NPS@預測FeTCP1蛋白的二級結構。預測顯示FeTCP1蛋白由51.85%的α螺旋、 15.93%的延伸鏈、5.37%的β-轉角和26.85%無規則卷曲結構組成。利用SWISS-MODEL預測蛋白質三級結構(圖4)，顯示FeTCP1與模板6nr8.1.O的三級結構序列同一性達66.35%，與二級結構預測結果基本一致。

2.3 FeTCP1在干旱與鹽脅迫下的表達分析

初步分析FeTCP1在甜蕎組織中的功能，利用qRT-PCR定量分析甜蕎幼苗葉片和根部在干旱和鹽脅迫誘導下的表達情況(圖5)。結果顯示在干旱處理下，FeTCP1在葉片中的表達量均高于對照，在干旱處理12 h左右達到峰值，其大致趨勢為先增后減；根的FeTCP1表達量均高于對照、葉片，在6 h達到峰值；在鹽處理下，發現FeTCP1的表達情況較為復雜，組織之間存在差異，葉片中FeTCP1的表達量呈上升趨勢，12 h后顯著高于根的表達量。在根中則呈現下降趨勢，在3 h左右達到峰值，之后逐漸下降。

3 討 論

TCP基因在植物中廣泛存在，已在擬南芥[5,11-13]、水稻[15]、玉米[14]、番茄[8-10]等植物中發現TCP參與植物脅迫后的應答反應[16]。水稻OsPCF2蛋白可通過與NHX1基因的啟動子結合激活其表達而提高鹽耐受性[17]，OsTCP19的過表達可通過上調IAA3、ABI3、ABI4和下調LOX2誘導一些信號通路從而提高擬南芥對干旱與高鹽脅迫的耐受性[18]。大多數TCP基因的上游區域至少包含一種激素相關元件，啟動子中包含一個或多個與脅迫相關的元件，但激活的時間存在差異[19]。TCP在轉錄水平和轉錄后水平上的調節對于植物響應多變的環境條件的發育可塑性至關重要[20]。研究發現大多數TCP基因在干旱脅迫中轉錄表達量均出現下調，僅且存在少量上調基因。這些研究證實TCP成員參與了干旱脅迫的反應過程，同時，推測出TCP成員在植物器官形態建成[21-24]、逆境應答中的功能特性[19]。

本研究從甜蕎中克隆出的FeTCP1共編碼540個氨基酸，從功能結構域分析表明，FeTCP1基因具有TCP1_alpha典型結構域屬于TCP-1家族-α亞單位。這些蛋白通常是由兩個堆疊環組成的雙圓環結構，介導多種細胞間隔中ATP依賴的多肽鏈折疊。通過選取不同雙子葉植物的同源序列構建系統發生進化樹，結果表明，FeTCP1與甜菜、睡蓮和罌粟親緣關系最近，與苦瓜的親緣關系相對最遠，表明TCP1基因在雙子葉藜科植物中存在著較高的同源保守性。本研究中FeTCP1基因在PEG與鹽誘導脅迫過程中葉片和根部中的表達量均出現上調，證實FeTCP1參與干旱脅迫調控，與前人研究相似[7,9]。但本研究中FeTCP1基因屬于TCP家族中少數上調基因，且FeTCP1的表達量在48 h的脅迫處理下先增后減。與其他研究不盡相同，這種差異可能由于物種間差異以及植物的生長發育階段的變化所導致。

甜蕎FeTCP1可以響應15% PEG 6000和0.1% NaCl鹽脅迫，證實FeTCP1基因參與干旱脅迫的應答調控。干旱響應機制主要包括光合作用、滲透調節、抗氧化系統以及各種蛋白質和代謝物合成等，主要涉及滲透穩態、脅迫傷害控制和生長控制3個方面。下一步的研究方向為通過轉基因技術探究FeTCP1主要參與干旱響應的哪些過程以及具體的調控機理機制，為培育優良的抗逆品種提供借鑒。