多孢木霉HZ-31菌株活性物質的初步分離及除草活性研究

朱海霞，藺澤榮，馬永強

(青海大學 農林科學院，青海大學 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，西寧 810016)

化學除草劑從應用至今已有70多年的歷史，在提高農作物產量方面起到不可低估的作用[1]。但從20世紀70年代中期以來，抗藥性雜草種類一直呈上升趨勢[2-3]。同時，隨著環境保護呼聲的日益提高，高毒性農藥的大量使用對農業生產及生態環境造成的負面影響已引起世界范圍的廣泛關注。為了保護人類生存環境和農業可持續發展，除草劑的研制與使用將嚴格受到環境和生態的制約[4]。利用雜草病原微生物代謝產物中的活性物質作為先導化合物，開發微生物源除草劑，是新型除草劑研究的重要方向[5]。利用微生物等新型生物研發新型除草劑已經迫在眉睫。

已報道的具有一定除草活性并有望開發成微生物除草劑的真菌代謝產物有100余種，涵蓋近20個屬[6]。Miwa等[7]通過發酵液分離提取技術，從海洋中的一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中獲得兩種具有抑制稗草生長的活性化合物新小環內酷類化合bacilosarcins A和B。Vikrant等[8]對莖點霉(Phomaherbarum)的代謝產物進行研究，從中分離到的3-硝基鄰苯二甲酸，對銀膠菊表現出很強的除草活性。這些研究都為新型微生物源除草劑的發掘和除草活性的先導化合物的探索奠定了基礎。

研究事實證明，具有除草活性微生物中蘊含著大量的天然活性產物，對這些天然活性化合物構效關系及其除草機制的持續研究，為新型除草劑研發開辟了有效途徑。此外，盡管有數以萬計的微生物被發現和鑒定，但仍然有超過現有已知10倍以上的微生物尚未被研究。因此，從大量微生物中開發生防除草產品潛力巨大[9-10]。

多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株是近來研究發現的對青海農田雜草藜(ChenopodiumalbumL.)、野燕麥(AvenafatuaL.)、密花香薷(ElsholtziadensaBenth)、萹蓄(PolygonumaviculareL.)、薄蒴草[Lepyrodiclisholosteoides(C.A. Mey.)]、酸模葉蓼(PolygonumlepathifoliumL.)等具有廣譜、高效除草活性的一種雜草病原真菌[11-12]。作物安全性結果表明，該菌株對青海省主栽作物——油菜嚴重致病[11]。為明確HZ-31菌株中除草活性物質，本研究選用野燕麥和油菜作為靶標雜草，利用該菌株的發酵液和發酵濾液進行除草活性對比，并在此基礎上經過4種有機溶劑萃取后，測定萃取物對雜草葉片的致病效果，確定檢測活性物質最佳有機相，為進一步研究其活性物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：多孢木霉HZ-31菌株由青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室分離保存，同時保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC No.12867。

供試植物：藜、野燕麥、密花香薷、萹蓄、薄蒴草、酸模葉蓼、冬葵、油菜。

供試培養基：PDA培養基，配方為去皮馬鈴薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.2 多孢木霉HZ-31菌株發酵培養及活性物質生測

1.2.1 多孢木霉HZ-31菌株發酵液和發酵濾液的制備 將多孢木霉菌株的斜面菌種制備成菌懸液，以φ=2%的接種量接種于PDB培養液，置智能恒溫搖床(ZWY-1102)23 ℃、150 r/min振蕩培養8 d，獲得發酵液[12]。發酵液用4層紗布過濾，去除菌絲體及雜質。于4 000 r/min離心30 min，獲得上清液。于4 ℃冰箱中靜置24 h后離心，去除沉淀物，獲得發酵濾液。

1.2.2 多孢木霉HZ-31菌株發酵液及發酵濾液對野燕麥和油菜種子萌發的影響 采用培養皿濾紙發芽法進行試驗。選取飽滿完整的野燕麥和油菜種子，用無菌水沖洗消毒。在直徑為9 cm 的培養皿中鋪上濾紙，分別加入待測生防菌發酵液及發酵濾液5 mL，每皿置20粒種子進行種子萌發試驗，每處理重復3次，以無菌水發芽處理作為對照。25 ℃條件下黑暗培養，每天打開蓋子通氣1 h，隔天每個培養皿補充相應處理液5 mL，采用ISTA規定的方法于第3天進行首次計數，之后每天1次，第7天進行末次計數。

以種子發芽長度超過種子本身長度作為種子萌發的標準，種子萌發抑制率計算公式為。

發芽率=第7天正常發芽種子總數/測試種子總數×100%。

種子萌發抑制率=(對照種子萌發率-處理種子萌發率)/對照種子萌發率×100%。

1.3 不同有機溶劑萃取物活性測定

1.3.1 不同有機溶劑萃取 參照“1.2.1”中的方法獲得發酵濾液，采用正丁醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯4種不同極性有機溶劑對4 L多孢木霉發酵濾液分別進行等體積萃取。振蕩充分混合，靜置過夜待分層后以分液漏斗將有機相與水相分開。萃取3次，合并相同有機相。利用旋轉蒸發儀 (EYEL)，正丁醇相45 ℃下旋轉蒸發，石油醚相和氯仿相37 ℃下減壓旋轉蒸發，乙酸乙酯相 34 ℃下旋轉蒸發，各萃取相旋蒸至有機溶劑全部揮發，粗提物濃縮獲得浸膏。各有機相浸膏用甲醇預溶后，再加入蒸餾水進行溶解，配制成 5 mg/mL和3 mg/mL粗提物溶液，備用。

采用離體葉片接種法和種子萌發法測定除草活性，判斷其活性物質的極性。采用離體葉片接種法和種子萌發法進行活性追蹤，根據葉片受侵染狀況及種子萌發抑制率確定除草活性物質極性組分。

1.3.2 離體葉片處理法測定除草活性 田間采集新鮮的野燕麥、冬葵、密花香薷、萹蓄、酸模葉蓼、薄朔草、藜雜草的葉片，置于自封袋后帶回室內用流動水沖洗，7種雜草葉片取各一片盛放在已滅菌并鋪有濾紙的大培養皿(φ=15 cm)中，采用針刺法將不同有機溶劑粗提物5 mg/mL溶液50 μL定量滴加在葉片上，以滴加甲醇的處理作為對照組。每處理重復3次。置于室溫自然光下，對7種供試雜草葉片受侵染狀況進行不定期觀測，通過葉片發黃、失綠、枯萎等病害癥狀確定侵染程度。比較4種極性有機溶劑粗提物對不同雜草葉片的離體致病性。

1.3.3 種子萌發處理法測定除草活性 將種子整齊擺放于鋪有濾紙的種子培養皿中，每皿野燕麥種子4粒、油菜種子8粒，加入濃度為5 mg/mL的各有機相粗提物溶液各100 μL，為減少溶劑對種子萌發的影響，粗提物溶液滴加到濾紙上，待濾紙完全干后再均勻滴加0.5 mL滅菌水，每個處理5次重復，甲醇作為空白對照。25 ℃±1 ℃下黑暗培養，5 d后統計發芽率和抑制率。

將濾紙平鋪在經滅菌處理的玻璃培養皿中，野燕麥種子20粒，油菜種子20粒，分別加入各有機相濃度3 mg/mL粗提物溶液各100 μL，待濾紙完全干后再均勻滴加3 mL滅菌水，每個處理3次重復，甲醇作為空白對照。25 ℃±1 ℃下黑暗培養，5 d后統計發芽率和抑制率。

2 結果與分析

2.1 多孢木霉HZ-31發酵培養及活性物質生測

由表1可以看出，HZ-31菌株發酵液對野燕麥和油菜的種子萌發抑制率分別為70.00%和86.67%，HZ-31菌株發酵濾液對野燕麥和油菜的種子萌發抑制率分別為80.00%和91.67%。對胚根、胚芽生長抑制作用明顯(圖1)。菌株發酵液和發酵濾液處理后，野燕麥和油菜的種子發芽率和萌發抑制率差異顯著，二者的胚芽和胚根抑制率無顯著差異。說明活性物質存在于發酵濾液和發酵液中，且發酵濾液中活性高于發酵液。

表1 HZ-31菌株發酵液及發酵濾液處理下野燕麥和油菜種子萌發Table 1 Seed germination of A.fatua and B.napus treated with fermentation broth and filtrate of strain HZ-31

2.2 不同有機溶劑萃取物除草活性分析

離體葉片接種法除草活性：用5 mg/mL的乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚、氯仿相分別處理7種雜草葉片，粗提物溶液處理1 d后，雜草葉片出現黃化，部分葉面變褐(圖2)。正丁醇粗提物對密花香薷、酸模葉蓼、冬葵離體葉片具有強烈的致病性，侵染后的病斑面積占整個葉面積的60%以上。對野燕麥、萹蓄、薄蒴草有中度侵染，病斑面積占整個葉面積的16%～59%。對藜有輕度侵染。乙酸乙酯相粗提物對藜和萹蓄葉片有輕微的致病性，對其余5種雜草葉片表現出中度侵染。石油醚相粗提物對藜、萹蓄和酸模葉蓼葉片有輕微的致病性，對其余4種雜草葉片表現出中度侵染。氯仿相粗提物對密花香薷和薄蒴草葉片有輕度侵染，對野燕麥和冬葵葉片有中度侵染(表 2)。結果表明不同有機相致病效果由強到弱表現為正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。確定最佳活性組分在正丁醇相中。

表2 4種極性有機溶劑粗提物對不同雜草離體葉片的致病性(處理后1 d)Table 2 Pathogenicity of four organic solvent extracts on different weeds in vitro(1 d after treatment)

正丁醇相處理1 d后，雜草葉片超過1/3葉面積出現黃化并產生病斑，處理3 d后，超過1/2葉面積失綠變褐，處理5 d后4/5葉片失綠，整個葉片枯黃萎蔫，其上產生白色霉層(圖2)。

種子萌發法除草活性：4種有機溶劑萃取相粗提物5 mg/mL溶液對野燕麥和油菜種子萌發均有強烈的抑制作用，除乙酸乙酯外，其余處理完全抑制胚芽、胚根生長，發芽抑制率為100%，無顯著性差異(表 3)。

表3 4種有機相粗提物對野燕麥、油菜種子的抑制Table 3 Inhibition of four kinds of organic fraction crude extracts on seeds of A.fatua and B.napus

4種有機相粗提物溶液對種子萌發的抑制作用表明，3 mg/mL濃度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麥和油菜種子的萌發，而該濃度下乙酸乙酯相粗提物對野燕麥種子發芽抑制率為 16.67%，對油菜種子發芽抑制率為53.70%。石油醚相和氯仿相粗提物對野燕麥種子發芽抑制率分別為25.92%和29.63%，對油菜種子發芽抑制率分別為62.97%和42.59%(表 3)。乙酸乙酯相、石油醚相氯仿相之間抑制率不存在顯著差異，正丁醇相與其他3種有機溶劑相相比差異顯著，因此，粗提物活性測定以離體葉片生測法和種子萌發結果為依據，確定最佳活性組分在正丁醇 相中。

3 討論與結論

萃取為從液相中提取分離有效成分的最常用手段。該方法是利用溶質在兩個互不相溶液相中溶解度的差異，將目的化合物從液體混合物中分離開來[13-14]。針對HZ-31菌株代謝產物中有效成分在兩相體系中的溶解的情況進行分析，挑選出可以用于萃取的溶劑。本研究選取正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿這4種有機溶劑進行萃取試驗，進而判斷其活性物質的極性。

多孢木霉菌株在高溫高濕條件下發病, 通過侵染植物引起腐爛,但是關于其產生的除草活性物質，目前未見報道。本研究發現HZ-31菌株發酵濾液對野燕麥和油菜的種子萌發抑制率分別為80.00%和91.67%，對胚根、胚芽生長抑制作用顯著，且發酵濾液活性高于發酵液。不同有機溶劑萃取物對7種雜草葉片的致病效果由強到弱表現為：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。5 mg/mL正丁醇粗提物對密花香薷、酸模葉蓼、冬葵離體葉片具有強烈的致病性，處理5 d后4/5葉片失綠，整個葉片枯黃萎蔫。4種有機溶劑萃取相粗提物5 mg/mL溶液對野燕麥和油菜種子萌發均有強烈的抑制作用，3 mg/mL濃度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麥和油菜種子的萌發。因此，粗提物活性測定以離體葉片生測法和種子萌發結果為依據，確定最佳活性組分在正丁醇相中。

利用雜草病原微生物代謝產物中的活性物質作為先導化合物，開發微生物源除草劑，是新型除草劑研究的重要方向[5]。篩選、利用和開發該類代謝產物，是目前雜草生防領域研究的熱點。Javaid等[14]報道哈茨木霉(T.harzianumRifai)、擬康氏木霉(T.pseudokoningiiRifai)、里氏木霉(T.reeseiSimmons)、綠色木霉(T.viridePers)的粗提物對麥田雜草小子虉草(PhalarisminorL.)、齒果酸模(RumexdentatusL.)有較好的抑制活性；Cimmino等[15]發現擬莖點霉屬(Phomopsissp.)產生的毒素可以防治澳大利亞馬紅花(Carthamuslanatus)等。這些研究都為發掘新型天然產物農藥和尋找具有除草活性的先導化合物奠定了基礎。

微生物發酵產物常常是伴有許多化合物的混合體，有效活性物質可能只是其中的一種或幾種，因此，分離純化是能夠將目的產物進行結構和性質研究的前提[16]。本研究通過離體葉片生測法和種子萌發法對多孢木霉HZ-31菌株活性物質進行了初步分離，并對除草活性進行了研究，下一步有望通過薄層層析、柱層析、高效液相色譜HPLC方法等分離分析技術對多孢木霉HZ-31菌株發酵液中的除草活性物質進行分離純化，逐步明確發酵液中除草作用的成分，并對其化學結構進行鑒定。