‘瑞雪’蘋果脫毒幼苗接穗采集區的研究

馮瑞芳，閆雷玉，孫建春，孫魯龍，趙政陽

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

蘋果樹體感染病毒是降低果實品質的重要因素之一[1]。蘋果樹體感染病毒后終生帶毒且無有效的防治措施，感染病毒后的樹體果實品質變劣，單株產量降低[2-3]，感病嚴重時還會導致樹體整株死亡[4-5]。控制病毒病害蔓延最有效的措施是栽植脫毒苗木。‘瑞雪’是西北農林科技大學選育的黃色晚熟蘋果優質新品種[6]，具有豐產、大果、味美等特點，是晚熟品種中少有的黃色品種[7]。‘瑞雪’蘋果新品種推廣過程中脫毒苗木的繁育非常重要，芽接技術可以提高接穗利用率、擴大繁殖系數以及加快‘瑞雪’蘋果的推廣速度。此外，從幼齡脫毒苗上采集接穗降低嫁接苗感染病毒幾率的同時還可實現采穗植株密植化，達到高效率苗木生產的目標。由于芽的異質性導致不同部位的芽體質量不同，使得苗木嫁接后表現也不同。核桃嫁接的研究表明，1a生枝條中部芽的成活率較高，新梢長到30～50cm掐頭后接穗的利用率高[8-9]。‘光輝’海棠和‘紅肉’蘋果芽接技術中發現，選擇枝條中部的芽成活率顯著高于其他部位的芽[10]。綜上所述，單芽接穗的選擇對于‘瑞雪’嫁接繁殖具有重要的意義。

目前，關于接穗的選擇主要集中在核桃的研究中，關于如何從脫毒蘋果幼樹上選擇接穗的研究較少。由于從脫毒幼樹上采集接穗有芽體營養不足、分化較差的風險，因此，有必要對不同節位的芽、葉以及采集接穗嫁接后的嫁接苗進行分析。本研究選擇長勢一致的1a生和2a生幼齡‘瑞雪’脫毒自根苗為試驗材料，從樹體基部向上每10個芽為一個采穗區，共分為5個采穗，對照為帶毒母樹1a生枝條中部的采穗區，采集各采穗區內1a生枝上的葉片及單芽，采集的葉片用以比較葉面積、葉片厚度、葉片柵欄組織厚度、葉綠素、淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白、多胺等生理指標的差異；采集的單芽嫁接至M26矮化自根砧上用以比較嫁接苗的長勢。通過不同采穗區嫁接前葉片指標和嫁接后芽接苗長勢的分析，篩選出最佳的接穗采集區，為‘瑞雪’幼齡脫毒苗單芽接穗的選擇提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

1.1.1 試驗材料 試驗地點位于陜西省白水縣西北農林科技大學白水蘋果試驗站(109°16′～109°45′E， 35°4′～35°27′N)，海拔860 m左右，地處黃土高原溝壑丘陵區，溫帶半濕潤大陸性季風氣候。

試驗材料為1 a生和2 a生‘瑞雪’脫毒自根苗，脫毒自根苗來源于西北農林科技大學園藝學院實驗室，運用莖尖超低溫和熱處理技術脫除病毒，經RT-PCR檢測已脫除APSV、ASGV、ACLSV 3種潛隱性病毒，在2018年4月和2019年5月煉苗1周后，定植于西北農林科技大學白水蘋果試驗站，定植前進行土壤改良和土壤消毒；定植株距0.6 m，行距3 m；M26脫毒矮化自根砧木2018年4月定植于試驗站，株距0.6 m，行距3 m。試驗對照試材為帶毒當年生枝條中部飽滿節位。對試驗所選試材進行常規幼苗管理措施，試材生長一致。

1.1.2 試驗設計 1 a生樹體從其基部向上每10個芽作為一個采穗區，2 a生樹體基部50 cm向上每10個芽作為一個采穗區，如表1所示，將幼樹分為5個采穗區，采集當年生枝條上的單芽和葉片，2019年9月1日選取1 a和2 a年生幼樹長勢一致且健康的幼苗各3棵，根據劃分的采穗區，每個采穗區采集3顆單芽接穗，使用帶木質嵌芽接方法嫁接到M26脫毒砧木，嫁接口高度距地面20 cm，對成活后的嫁接苗進行常規管理。嫁接時采集各采穗區的葉片洗凈后液氮凍存備用,每個處理重復3次。

表1 ‘瑞雪’脫毒自根苗采穗分區Table 1 Partition of scion cutting of ‘Ruixue’ free-virus self-root seedlings

1.2 測定指標及方法

1.2.1 葉面積測定 運用托普云農YMJ-D型手持活體葉面積測量儀測得。

1.2.2 葉片解剖結構測定 將新鮮葉片避開葉脈剪成1 cm的方塊，經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、脫蠟、番紅固綠染色、封片后制成永久性切片；奧斯巴林正置熒光顯微鏡拍得照片，用奧斯巴林配套軟件測得葉片厚度和柵欄組織厚度[11]。

1.2.3 葉片生理生化指標測定 葉綠素含量用丙酮法測定[12]；淀粉含量用蒽酮比色法測定[13]；可溶性糖含量用蒽酮比色法測得[13]；可溶性蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定[14]；多胺含量測定方法，參照劉俊等[15]的高效液相色譜法測進行多胺測定，色譜條件為流動相：V(甲醇)∶V(乙腈)∶水=58∶2.5∶39.5，流速1 mL/min，波長230 nm，多胺標準品購于上海源葉生物有限公司官網，多胺測定儀器使用日本島津LC-30A超高效液相色譜儀。

1.2.4 脫毒嫁接苗樹高、干徑測定 2020年10月初嫁接苗趨于停止狀態測定嫁接苗樹高和干徑，用卷尺由嫁接口處至最高生長點測定幼苗的高度，干徑取嫁接口上10 cm光滑部位，用游標卡尺在東、西、南、北方向各測量一次后取平均值。

1.3 數據分析

利用SPSS 19.0軟件進行方差分析，多重比較采用LSD 法(P<0.05)，Excel 2013軟件進行表格和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同采穗區葉面積的變化

葉面積測定結果表明，1 a生‘瑞雪’(圖1-A)隨著節位增高葉面積有增大的趨勢，1 a生第3采穗區葉面積最大，為5 841.76 mm2，葉面積最小的是第5采穗區。2 a生‘瑞雪’葉面積(圖1-B)隨著節位增高葉面積有先增后降的趨勢，第3采穗區的葉面積最大，為6 181.81 mm2，高于對照4.3%，葉面積最低的是第1采穗區。

2.2 不同采穗區葉片解剖結構

葉片結構的變化與葉片質量正相關，影響葉片活性和光合作用，葉片通過光合作用產生的有機物為腋芽提供充足的營養物質[16-17]。葉片厚度的結果表明，隨著節位升高葉片厚度呈先升高后降低的趨勢，1 a生和2 a生‘瑞雪’在第3采穗區葉片厚度分別為242.39 μm和244.07 μm；1 a生樹體低于對照6.1%，2 a生樹體與對照相比沒有顯著性差異(圖2)。

葉片柵欄組織厚度(圖3)，1 a生和2 a生‘瑞雪’葉片柵欄組織厚度隨節位升高呈現先增加后降低趨勢，1 a生和2 a生‘瑞雪’第3采穗區柵欄組織分別為101.55 μm和105.46 μm， 1 a生樹體第3采穗區顯著低于對照10.2%，2 a生‘瑞雪’第3采穗區的柵欄組織與對照無顯著性差異。

2.3 不同采穗區生理生化指標的變化

2.3.1 葉綠素含量 葉綠素在光合作用對于能量捕獲和傳遞至關重要，葉綠素的含量影響有機物質的積累[18]。圖4中1 a生‘瑞雪’5個采穗區間葉綠素含量沒有顯著性差異并均低于對照。2 a生‘瑞雪’隨著節位的升高葉綠素含量增加，葉綠素含量最少的是第1采穗區，第3采穗區葉綠素含量最高為3.96 mg/g，與對照在0.05水平上沒有顯著差異。

2.3.2 碳水化合物含量 碳水化合物的積累有利于腋芽的飽滿程度，是芽分化的重要物質基礎[19]。1 a生‘瑞雪’淀粉含量為2.12 mg/g，顯著低于對照 20.8%(圖5-A)；2 a生‘瑞雪’的第3采穗區淀粉含量最高，為2.61 mg/g，顯著低于對照2.9%(圖5-B)。

1 a生‘瑞雪’可溶性糖含量呈先升高后降低趨勢，第3采穗區可溶性糖含量最高，為2.25 mg/g，顯著低于對照34.8%(圖6-A)。2 a‘瑞雪’可溶性糖含量最高的是第3采穗區，含量為 3.36 mg/g，低于對照2.6%(圖6-B)。

2.3.3 可溶性蛋白含量 蛋白質是細胞分裂、分化的主要物質基礎, 其含量變化與花芽分化也有密切關系[20]。1 a生和2 a生‘瑞雪’5個采穗區中第3采穗區可溶性蛋白質含量最高，分別為 0.74%和0.73%，分別低于對照2.6%、3.9% (圖7)。

2.3.4 多胺含量 多胺是細胞學中的重要調控物質，缺少多胺使細胞增殖分化困難，導致細胞生長緩慢。另外，多胺可顯著促進果樹花芽形成[21-22]。

1 a生和2 a生‘瑞雪’葉片中亞精胺(Spd)含量最高，在第3采穗區處到達高峰(47.75 μmol/g)之后下降，與對照無顯著性差異(表2)。2 a生樹體第3采穗區含量最高，為45.78 μmol/g，與對照無顯著性差異。

1 a生‘瑞雪’5個采穗區中腐胺(Put)含量差異不顯著，第3采穗區Put含量最高，為26.83 μmol/g，顯著低于對照5.21%(表2)。2 a生‘瑞雪’第3采穗位Put含量為29.59 μmol/g，與對照相比在0.05水平上有顯著性差異(表2)。

1 a生和2 a生‘瑞雪’葉片中精胺(Spm)是3種多胺中含量最低的，1 a生‘瑞雪’第3采穗區含量最高為21.44 μmol/g，低于對照14.37%。2 a生樹體第3采穗區Spm含量顯著高于其他采穗區，為22.56 μmol/g，與對照無顯著差異。

2.4 不同采穗區接穗的嫁接苗生長量

如表3所示，選自1 a生自根苗第3采穗區的嫁接苗的生長量顯著高于其他采穗區，樹高高于對照16.9%，干徑高于對照9.2%，總節數高于對照17.8%，側枝數與對照無顯著差異；選自2 a生自根苗第3采穗區的嫁接苗生長量高于其他4個采穗區，樹高顯著高于對照15.8%，干徑高于對照8.7%，總節數高于對照9.6%，側枝數高于對照6%。脫毒苗除1 a生第1采穗區的干徑和2 a生第1采穗區嫁接苗的干徑低于對照，其他采穗區芽接苗的樹高、干徑、側枝數和總節數均高于對照。

3 討 論

3.1 葉片質量對腋芽質量的影響

葉片質量可以體現樹體的營養生長狀態，葉面積大接受光照射面積也大，有利于制造有機物質[23]。研究表明葉片解剖結構與光合作用密切相關，光合速率與葉片厚度、葉片柵欄組織正相關，葉片柵欄組織厚度越厚越有利于光能捕捉，此外葉片也有一定儲存有機物質的能力[24-25]。源-庫學說理論中，樹體的葉片為代謝源，同節位的芽為代謝庫，代謝源的強度最先影響到離代謝源最近的代謝庫[26]。本研究發現樹體中部采穗區的葉片面積、葉片解剖結構測得結果優于基部和頂部，30～40節(1 a)、60～70節(2 a)葉片中淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白質、多胺等內含物高于其他節位，此部分的葉片制造有機物質的能力高，此外，選用上述采穗區內芽作為接穗的芽接苗生長勢優于其他節區，基于源-庫學說可以明確地解釋這一現象，處于此采穗區的腋芽內有機物質多、芽體飽滿，可為翌年嫁接苗的生長提供必要的物質基礎。

3.2 芽質量對嫁接的影響

芽的異質性導致同一枝條不同部位的芽存在著大小、飽滿程度等一些差異[27]。秋季芽接應選取枝條中段充實飽滿的芽作為接芽[28]。桑娟萍等[29]在核桃芽接的研究中發現，取同一枝條不同部位的芽子做接穗，中部芽子的嫁接成活率為78%，基部的芽子嫁接成活率為70%。趙輝等[30]在研究核桃不同部位芽對嫁接成活率的影響中發現中部芽子成活率最高，上部次之，且中部芽子較上部和下部的芽生長最快。這與本研究結果一致，本研究中1 a生幼苗的中上部和2 a生樹體的中部葉片結構和生理生化指標則處于較高的水平，使得其腋芽飽滿程度高于其他節位的腋芽。優質飽滿的芽體有利于嫁接后成活率、愈合情況以及翌年的長勢。

糖類作為植物主要的同化物質，在植物的生長發育和形態建成中起著重要的作用[31]，研究表明花芽分化進度和蔗糖、可溶性糖的含量正相關[32]。多胺作為具有活性的物質，在植物成花轉變中起調控作用[33]。Put、Spd有利于龍眼的營養生長，Spm有利于花芽分化[34]。奈李花芽分化期間Put含量降低，Spd、Spm出現高峰。Put是Spd和Spm合成的底物、Put含量直接影響到后兩者的含量[35]。有研究表明， miR156過量表達抑制植物開花時期， ‘寒富’離體試管苗中miR156的表達量顯著高于田間苗[36]。由于試管苗中miR156的表達量高于田間苗，由試管苗獲得的脫毒自根苗可能會出現開花延遲等現象，那么接穗的選擇不光要考慮芽體的質量還需考慮果樹不同節位花芽分化的問題。

本研究中1 a生樹體30～40節(第3采穗區)、2 a生樹體60～70(第3采穗區)節的可溶性糖、可溶性蛋白質含量、多胺總含量顯著高于其他采穗區；1 a生、2 a生樹體各節區 Spd含量最高，Put含量次之，Spm含量最低。本研究發現1 a生‘瑞雪’30～40節(第3采穗區)和2 a生‘瑞雪’60～70節(第3采穗區)葉片中的葉面積、可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白和多胺含量最高，使用此采穗區嫁接成活后苗木的營養生長優于其他節區并顯著高于對照。

4 結 論

通過對1 a生和2 a生‘瑞雪’脫毒自根苗各個采穗區葉片生理指標的分析比較，綜合不同采穗區芽接苗成活后生長勢的分析，初步得出以下結論：生產中使用幼齡‘瑞雪’脫毒自根苗采集接穗時，接穗的最佳采集區域為：1 a生‘瑞雪’樹體30～40節，對應樹高40～58 cm；2 a生樹體的 60～70節，對應樹高117～139 cm。