11個玉米DOF基因?qū)δ婢趁{迫的表達(dá)模式分析

賈利強(qiáng),趙秋芳,陳 曙

(1.貴州師范學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550018；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣東湛江 524091)

DOF蛋白家族是植物特有的，在其N端含有高度保守DOF結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛地參與植物生長發(fā)育進(jìn)程以及植物抵御各種逆境脅迫的信號途徑。第一個克隆的DOF基因是玉米DOF1[1]。后續(xù)研究表明，植物DOF基因參與調(diào)控植物生長發(fā)育的諸多方面，諸如植物開花[2-4]、植物生長[5]、種子的休眠與萌發(fā)[6]、植物色素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-8]、碳氮代謝[9]以及植物的抗逆性[10-11]等。近些年來，隨著越來越多植物基因組測序研究的開展，植物DOF基因家族數(shù)目、分布和組織時(shí)空表達(dá)模式以及應(yīng)答各種逆境脅迫的響應(yīng)模式也得到廣泛研究。低等植物諸如植物藻類和苔蘚基因組中編碼的DOF基因數(shù)目比較少[12]，而高等植物多。第一個報(bào)道DOF基因家族的植物是擬南芥和水稻，分別編碼36個和30個DOFs[12], 隨后對玉米[13]、小麥[14]、番茄[15]、西瓜[16]、木薯[17]、堅(jiān)果和蓖麻[18]等植物進(jìn)行了報(bào)道。植物DOF基因家族的廣泛研究為后續(xù)揭示DOF基因功能提供了有用信息。

DOF蛋白是植物特有的含有C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在其N端，一般含有能特異性識別順式作用元件AAAG的保守基序序列，調(diào)控下游基因表達(dá)[5]。在DOF蛋白C端，一般是由不保守的具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的氨基酸序列組成[19]。維持植物碳氮代謝平衡對于植物的正常生長發(fā)育具有重要意義，并且這一過程受到基因網(wǎng)絡(luò)精密調(diào)控，包括DOF基因家族。在擬南芥中過表達(dá)毛白楊PpDOF5會增加木質(zhì)素含量，影響碳氮代謝平衡[9]。在氮素缺乏條件下，玉米DOF1基因會增加水稻對碳氮的吸收[20]。在擬南芥中也得到類似結(jié)果，在氮素缺乏環(huán)境下，過表達(dá)AtDOF1基因能增加擬南芥根系對氮素的吸收效率[21]。OsDOF24和OsDOF25參與碳氮代謝平衡，過表達(dá)OsDOF25會影響有機(jī)酸代謝，同時(shí)還會影響銨態(tài)氮吸收[22]。OsDOF18也會增加水稻的銨態(tài)氮吸收[3]。玉米作為中國三大主糧之一，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對于保障中國糧食安全意義重大[23]。在玉米生長周期內(nèi)，各種逆境脅迫諸如干旱氣候、貧瘠土壤、鹽堿地等造成玉米產(chǎn)業(yè)遭受較大損失，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和糧食安全。本研究模擬干旱、鹽和氮素缺乏脅迫，系統(tǒng)研究11個ZmDOF基因的時(shí)空組織表達(dá)模式以及應(yīng)答各種逆境脅迫的響應(yīng)模式，以期為后續(xù)研究這些基因的生物學(xué)功能提供數(shù)據(jù)和支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為玉米自交系‘鄭58’，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米育種基地(廣東湛江)，抽雄期進(jìn)行根、莖、葉、雄花以及授粉15 d 幼穗和苞葉取樣，液氮速凍并保存在-80 ℃冰箱，備用。對于脅迫試驗(yàn)，玉米種子經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)為5%次氯酸鈉溶液消毒5 min，水沖洗后置于培養(yǎng)箱中萌發(fā)，將發(fā)芽一致的種子轉(zhuǎn)移到Holland營養(yǎng)液中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行營養(yǎng)液配制以及各種脅迫處理試驗(yàn)。為了分析ZmDOF基因?qū)ο鯌B(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的響應(yīng)模式，將生長2周且長勢一致的玉米幼苗轉(zhuǎn)移至含0.02 mmol/L的KNO3或者NH4Cl營養(yǎng)液中，分別處理0 h、1 h、6 h和24 h后取葉片，液氮速凍并置于-80 ℃冰箱保存。為了分析ZmDOF基因?qū)Ω珊岛望}脅迫的響應(yīng)模式，將生長2周且長勢一致的玉米幼苗分別轉(zhuǎn)移到20%的PEG6000溶液和200 mmol/L的NaCl溶液中，分別在0 h、1 h、6 h和24 h取玉米葉片，液氮速凍后，于-80 ℃冰箱保存，備用。每個取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)置 3 個重復(fù)。

1.2 RNA提取與定量PCR

取0.1 g樣品，利用RNA Simple Total RNA Kit (天根, 北京,中國)提取組織總RNA，RNA質(zhì)量濃度與純度用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Massachusetts, USA)進(jìn)行測定。RNA提取的完整度用10 g/L瓊脂膠進(jìn)行驗(yàn)證。5 μg總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)利用羅氏Light Cycler 480 實(shí)時(shí)定量 PCR儀進(jìn)行，2-△△Ct算法[25]計(jì)算結(jié)果。采用Oligo 7設(shè)計(jì)引物，玉米Actin用作內(nèi)參基因，引物序列見表1。基因的相對表達(dá)水平用ZmDOF/Actin來表示。每個PCR數(shù)據(jù)重復(fù)4次并取其平均值。

表1 11個ZmDOF基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primer of11 ZmDOF genes

1.3 ZmDOF鑒定、序列比對及進(jìn)化樹分析

11個玉米DOF基因和蛋白序列及染色體位置等信息來自于PHYTOZOME在線數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，擬南芥相關(guān)信息來源于在線數(shù)據(jù)庫tair(https://www.arabidopsis.org/)。11個ZmDOF蛋白序列和36個擬南芥的AtDOF蛋白序列構(gòu)成1個數(shù)據(jù)矩陣，利用MAFFT在線軟件L-INS-i算法進(jìn)行序列比對(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)，去除不保守序列，利用MEGA軟件NJ算法 (http://www.magasoftware.net/)構(gòu)建進(jìn)化樹，參數(shù)設(shè)定為p-distance，pairwise deletion of gaps，bootstrap值設(shè)定為1 000。

1.4 ZmDOF染色體定位，基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)ZmDOF基因在玉米基因組中的物理位置，用MapInspect軟件繪制ZmDOF在染色體中的位置(http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)。通過比較cDNA序列與對應(yīng)的基因組序列，利用在線網(wǎng)站GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)比對繪制ZmDOF的顯子-內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)。利用在線軟件MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 11個ZmDOF的生物信息學(xué)分析

11個ZmDOF基因散布于5個染色體上(圖1-A)，其中Chr 3上有4個，Chr1、Chr7和Chr8上各有2個，Chr6上有1個。11個ZmDOF基因編碼氨基酸的長度為223 aa(ZmDOF44)～618 aa (ZmDOF18), 對應(yīng)的分子質(zhì)量(MW)為24.02 ku～67.02 ku。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)為6.51 (ZmDOF7)～9.99 (ZmDOF36)，整體來看，PI值偏堿性(表2)。DOFs轉(zhuǎn)錄因子N端含有高度的保守蛋白基序，約由50～52個氨基酸組成，其中包含典型C2-C2類型指狀結(jié)構(gòu)域，結(jié)合調(diào)控元件(A/T)AAAG，調(diào)控下游基因的表達(dá)[15]。利用在線軟件MAFFT進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明11個ZmDOF蛋白N端都含有保守的蛋白結(jié)構(gòu)(圖1-B)。利用在線軟件CSDS預(yù)測11個ZmDOF基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明7個ZmDOF基因不含有內(nèi)含子，ZmDOF2和ZmDOF7只有 1 個內(nèi)含子，ZmDOF22有2個內(nèi)含子，而ZmDOF18有4個內(nèi)含子(圖1-C)。11個ZmDOF蛋白和36個擬南芥AtDOF蛋白整合為一個蛋白數(shù)據(jù)陣列，利用MEGA 7分析親緣關(guān)系，結(jié)果表明11個ZmDOFs可以分為4個家族，5個基因(ZmDOF21，ZmDOF22，ZmDOF36，ZmDOF41和ZmDOF44)歸類為一個亞家族，ZmDOF2,ZmDOF7,ZmDOF39和ZmDOF40歸類為一個亞家族，ZmDOF17和ZmDOF18劃分為兩個不同的亞家族，預(yù)示在ZmDOF基因進(jìn)化歷程中，不同亞家族內(nèi)發(fā)生了明顯的基因獲得和缺失事件。

2.2 11個ZmDOF蛋白基序分析

利用在線軟件MEME分析11個ZmDOF蛋白的基序序列，6個高度保守的蛋白基序及其在11個ZmDOF蛋白的分布見圖2。Motif 1高度保守，含有C2-C2型指狀結(jié)構(gòu)域，分布在11個ZmDOF蛋白N端。Motif3和Motif 5分別分布在8個ZmDOF和2個ZmDOF蛋白的N端。Motif 2和Motif 4分別分布于6個ZmDOF蛋白序列C端。Motif 6則分布在2個ZmDOF蛋白的中間部位。Motif分布模式在家族內(nèi)具有保守性，亞家族Ⅰ和Ⅳ具有類似的蛋白基序分布模式，體現(xiàn)了ZmDOF基因進(jìn)化過程中的功能保守性。

表2 11個ZmDOF的生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatic analysis of 11 ZmDOF genes

2.3 11個ZmDOF基因的組織表達(dá)分析

已有報(bào)道表明DOF基因廣泛參與植物的生長發(fā)育，這一點(diǎn)也得到ZmDOF基因組織表達(dá)模式數(shù)據(jù)的支持[13]。為了探測11個ZmDOF基因在玉米不同組織中的表達(dá)模式，取樣6個玉米組織：根、莖、葉、苞葉、雄花和授粉15 d的幼穗，用qRT-PCR進(jìn)行測定。結(jié)果表明(圖3)6個ZmDOF基因(ZmDOF17、ZmDOF18、ZmDOF21、ZmDOF36、ZmDOF41和ZmDOF44)具有組織特異性表達(dá)模式，主要在雄花中表達(dá)，表達(dá)量分別是根部的295倍、1 215倍、2 971倍、97倍、36倍和100倍，預(yù)示這些基因在玉米雄花的生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。其他4 個基因至少在2個或2個以上的組織中表達(dá)，表明這4個基因廣泛地參與玉米的生長發(fā)育進(jìn)程。這些研究數(shù)據(jù)與玉米基因組數(shù)據(jù)庫(https://maizegdb.org)中公布的基因表達(dá)數(shù)據(jù)基本一致，也存在細(xì)微差別，例如ZmDOF18和ZmDOF44除主要在玉米雄花中表達(dá)外，在幼嫩種子中的表達(dá)量也比較高，這可能體現(xiàn)了基因表達(dá)具有品種特異性。這些數(shù)據(jù)表明ZmDOF基因家族成員的進(jìn)化保守性。

2.4 11個ZmDOF基因?qū)}和干旱脅迫的響應(yīng)表達(dá)模式

已有一些報(bào)道表明，DOF基因功能與植物抵御環(huán)境逆境脅迫有直接或間接的關(guān)系，其表達(dá)模式會受逆境脅迫的影響[26]。鹽和干旱脅迫對玉米產(chǎn)量影響巨大，培育高抗鹽脅迫和干旱脅迫的新品種對玉米產(chǎn)業(yè)高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)至關(guān)重要。利用200 mmol/L NaCl和20% PEG6000人為模擬鹽脅迫和干旱脅迫，分別在0 h、1 h、6 h和24 h取樣，探究這些基因的表達(dá)模式。結(jié)果如圖4所示，11個ZmDOF基因的表達(dá)模式都受到鹽或干旱脅迫的誘導(dǎo)或抑制，表明這些基因廣泛地參與玉米應(yīng)答鹽或干旱脅迫的響應(yīng)途徑。在鹽脅迫1 h時(shí)，有9個ZmDOF基因出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)，表達(dá)豐度達(dá)到最高值，其中有 3 個基因(ZmDOF7,ZmDOF41和ZmDOF44)的表達(dá)量上調(diào)超過5倍，之后表達(dá)量出現(xiàn)回落，甚至低于處理前。例如ZmDOF41在脅迫處理1 h時(shí)，表達(dá)量上升11倍，在24 h時(shí)又出現(xiàn)回落。而ZmDOF2在處理24 h時(shí)受到明顯抑制，比處理前低約10倍。這些結(jié)果表明這9個ZmDOF基因是玉米應(yīng)答鹽脅迫的早期響應(yīng)基因，在玉米抵御鹽脅迫早期發(fā)揮作用。類似結(jié)果在甘蔗DOFs中也有報(bào)道[27]。在干旱脅迫下，這些基因的表達(dá)模式和鹽脅迫明顯不同。在PEG6000脅迫處理1 h時(shí)，9個ZmDOF基因受到明顯誘導(dǎo)，表達(dá)量增強(qiáng)，脅迫處理24 h達(dá)到最高峰。例如ZmDOF17和ZmDOF21在處理1 h時(shí)，表達(dá)量增強(qiáng)3倍左右，到 24 h時(shí)，分別增至36倍和21倍左右。在PEG6000脅迫處理下，共有7個基因表達(dá)量上調(diào)超過5倍，表明這11個ZmDOF基因也廣泛參與玉米應(yīng)答干旱脅迫的響應(yīng)途徑。

2.5 11個ZmDOF基因?qū)Σ煌螒B(tài)脅迫的響應(yīng)分析

DOF轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育和代謝平衡以及應(yīng)答各種逆境脅迫途徑[3]。過表達(dá)ZmDOF1促進(jìn)擬南芥、水稻和馬鈴薯等植物的氮素吸收，會使植物更能耐受氮素缺乏脅迫[27]。水稻OsDOF18也有類似效果[28]。這些基因表達(dá)模式也會受到氮素缺乏脅迫的影響。為了探測這11個ZmDOF基因應(yīng)答不同氮形態(tài)缺乏脅迫時(shí)的響應(yīng)模式，利用qRT-PCR技術(shù)測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮缺乏對三葉期玉米幼苗DOF基因的影響。結(jié)果如圖5所示，11個ZmDOF基因的表達(dá)模式都受到氮缺乏脅迫影響，在銨態(tài)氮缺乏脅迫1 h時(shí)，5個ZmDOF基因(ZmDOF21、ZmDOF22、ZmDOF36、ZmDOF41和ZmDOF44)都受到明顯誘導(dǎo)，其中ZmDOF22、ZmDOF41和ZmDOF44受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其表達(dá)水平比對照分別上升101倍、5.8倍和76倍，表明這6個基因是應(yīng)答銨態(tài)氮缺乏脅迫時(shí)的早期響應(yīng)基因，之后又逐漸降低。ZmDOF17和ZmDOF18在脅迫處理早期沒有發(fā)生明顯改變，但是在處理24 h時(shí)出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)上調(diào)，預(yù)示這2個基因是晚期響應(yīng)基因，在玉米應(yīng)答銨態(tài)氮缺乏脅迫的后期參與響應(yīng)途徑。ZmDOF2和ZmDOF39在脅迫處理早期表達(dá)受到抑制，脅迫處理24 h時(shí)又恢復(fù)到處理前的表達(dá)水平，表明這2個基因在玉米應(yīng)答銨態(tài)氮脅迫早期發(fā)揮生物學(xué)作用。硝態(tài)氮處理1 h時(shí)，7個ZmDOF基因(ZmDOF2、ZmDOF7、ZmDOF17、ZmDOF21、ZmDOF36、ZmDOF41和ZmDOF44)出現(xiàn)顯著上調(diào)，其中有5個基因表達(dá)量上調(diào)超過5倍，之后出現(xiàn)快速回落，處理24 h時(shí)，其表達(dá)量比處理前明顯降低，表明這些基因是應(yīng)答硝態(tài)氮缺乏脅迫的早期響應(yīng)基因。ZmDOF18和ZmDOF39受到硝態(tài)氮缺乏脅迫明顯抑制，在處理24 h時(shí)，其表達(dá)水平下降約10倍，表明這些基因的作用機(jī)制和其他ZmDOF基因不同，在玉米應(yīng)答氮脅迫時(shí)發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。這些數(shù)據(jù)表明這11個ZmDOF基因廣泛受到不同氮形態(tài)缺乏脅迫影響，預(yù)示ZmDOF基因以不同方式廣泛參與調(diào)控玉米應(yīng)答氮脅迫響應(yīng)途徑。

3 討 論

DOF基因家族廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育進(jìn)程，諸如開花響應(yīng)，花藥發(fā)育，種子生長，還通過調(diào)控植物細(xì)胞周期、維管束形成、氣孔形態(tài)建成和花器官脫落等過程來直接或間接地影響植物形態(tài)建成[4, 6,8,11, 14,29-30]。基因表達(dá)模式能為基因功能研究提供有用信息，隨著基因組測序計(jì)劃的推進(jìn)，近年來，植物DOF基因的組織表達(dá)模式有廣泛研究報(bào)道。甘蔗SsDOF7、SsDOF23和SsDOF24呈現(xiàn)組成性表達(dá)模式[27]，辣椒CsDOF基因在不同組織器官中表達(dá)模式多樣化[31]，在植物根、莖和葉等主要營養(yǎng)器官中表達(dá)[11,13,27]，在植物的花、漿果和種子主要植物生殖器官中表達(dá)[4,6,8]。有報(bào)道認(rèn)為大多數(shù)玉米DOF基因在莖、根、葉中表達(dá)比較高，而在胚、胚乳和種子等組織表達(dá)量低[4]，而本研究結(jié)果說明，有5個ZmDOF基因主要在雄花中表達(dá)，為雄花特異表達(dá)基因，4個基因在2個以上的組織中表達(dá)，包括根、莖、葉和幼嫩種子等，這些結(jié)果表明ZmDOF基因在玉米生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著多樣作用。

DOF基因家族廣泛參與植物抵御逆境脅迫途徑，一部分證據(jù)來自于DOFs表達(dá)模式在逆境脅迫下發(fā)生了明顯改變。甘蔗DOF基因受到各種逆境脅迫諸如溫度、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)[27]。類似結(jié)果也出現(xiàn)在番茄SICDF1-5以及SsDOF等[32]。本研究結(jié)果也支持這一點(diǎn)，在鹽和干旱脅迫下，11個ZmDOF基因表達(dá)發(fā)生明顯改變，表明這些基因廣泛參與玉米應(yīng)答鹽或干旱脅迫響應(yīng)途徑。11個基因響應(yīng)鹽或干旱脅迫時(shí)的表達(dá)模式不同，前者多數(shù)ZmDOF基因呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)模式，而在干旱脅迫時(shí)，多數(shù)ZmDOF基因表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)， 24 h時(shí)達(dá)到最高峰，表明這11個ZmDOF基因在玉米抵御鹽或干旱脅迫時(shí)，可能存在不同的應(yīng)答響應(yīng)機(jī)制。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果出現(xiàn)不一致，例如在前人研究中，ZmDOF36強(qiáng)烈受到鹽脅迫誘導(dǎo)，表達(dá)強(qiáng)度上升40倍，而基本不受干旱脅迫誘導(dǎo)[13]。而在本研究中，鹽脅迫處理時(shí)，ZmDOF36表達(dá)先上升后下降，而在干旱脅迫時(shí)，其表達(dá)持續(xù)受到誘導(dǎo)上調(diào)，在處理24 h上升6倍。這種結(jié)果差異可能是由于脅迫處理方式不同，以及取樣測定時(shí)間差異等原因造成的。

DOFs蛋白通過調(diào)控氮代謝相關(guān)途徑基因表達(dá)參與植物對氮素的吸收利用。玉米DOF1基因能促進(jìn)擬南芥、水稻和馬鈴薯等植物對氮素的吸收利用。小麥TaDOF1基因過表達(dá)株系可促進(jìn)谷氨酰胺合成酶和谷氨酸酶表達(dá)，影響小麥的氮肥利用效率[33]。水稻OsDOF18基因可介導(dǎo)氨氮運(yùn)輸和氮分布，影響植物的氮素使用效率[3]。過表達(dá)SICDF3會影響碳氮代謝平衡，最終影響擬南芥對氮素的吸收利用[32]。外界氮素水平影響植物DOFs的表達(dá)模式，通過DOFs來調(diào)控代謝相關(guān)下游基因表達(dá)，最終調(diào)控植物對氮素的吸收利用。越來越多的報(bào)道表明外界氮素水平調(diào)控植物DOFs表達(dá)水平。已有報(bào)道植物DOF基因受到外界氮缺乏脅迫的明顯誘導(dǎo)[3，31-34]。水稻DOF18基因受氨態(tài)氮脅迫誘導(dǎo)，受硝態(tài)氮脅迫抑制[3]。本研究結(jié)果與前人研究基本一致，多數(shù)玉米DOF基因的表達(dá)受到不同氮形態(tài)缺乏脅迫的影響，預(yù)示著玉米DOF家族基因應(yīng)答不同氮形態(tài)脅迫時(shí)的保守性和多樣性，表明ZmDOF基因廣泛地參與調(diào)控玉米氮素代謝平衡并發(fā)揮著各自獨(dú)特作用。