他克林對豬精子凍后質量、抗氧化能力及糖代謝的影響

陳志英，胡傳活 ，唐胤晟，鄧祝新，許 鵬，馮顯鈐，許春榮，劉德玉，馮 妮，謝運法，李 銘

(1.廣西大學 動物科技學院，南寧 530004； 2.廣西畜禽品種改良站，南寧 530001；3.廣西科達畜禽改良有限責任公司，南寧 530001；4.來賓市畜牧站，廣西來賓 546100)

冷凍精液在畜禽繁殖育種中有保存時間長、成本低、受運輸環境影響小、跨區域育種、減少疾病傳播等優點，促使精液冷凍技術飛速發展。但因豬精子對溫度極其敏感，在冷凍解凍過程中易于應激損傷，導致在生產中使用冷凍精液進行人工授精時產仔率比常規液態保存精液低20%～30%[1]。因此，探索如何改善豬精子冷凍稀釋液進而提高冷凍豬精液在市場中的運用具有重要的研究意義和發展前景。

Hu等[2]首次將他克林加入豬精液冷凍稀釋液中，并發現0.05、0.10、0.15mmol/L 他克林可以顯著或極顯著地提高豬精子的凍后質量，其中濃度為0.10mmol/L時效果最好。在此基礎上，黃明光等[3]研究發現，他克林對豬精液的常溫及低溫保存也具有積極作用，其結果也是濃度0.10mmol/L他克林的效果最佳，說明稀釋液中他克林能夠延長精子的壽命從而顯著地改善豬精子的保存效果。但有關他克林對豬精液保護作用的機制尚未有相關研究報道。因此，本研究在Hu等[2]及黃明光等[3]的基礎上選取濃度為0.10mmol/L他克林開展試驗，以杜洛克公豬為對象，探究他克林對凍融豬精子生物學特性的影響，為促進豬精子的冷凍保存提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及耗材

他克林購自藥雅科技(上海)有限公司；0.25 mL塑料細管，購于法國卡蘇生物公司；線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒(JC-1)、AO熒光染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司；考馬斯藍R250及己糖激酶(hexokinase，HK)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、丙酮酸(pyruvicacid，PA)、總抗氧能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購于索萊寶生物公司；活性氧(reactive oxygen species ,ROS)檢測試劑盒購于碧云天生物公司。精液冷凍液(Ⅰ液、Ⅱ液)及解凍液參照王昕等[4]的方法配制。

1.2 主要儀器

Digitcool程序化自動冷凍儀及SCA自動精液分析儀，購自法國卡蘇公司；SD-2數碼液晶顯微鏡，購自深圳泰宇星光電儀器有限公司；電子車載冰箱，購于北京福意聯電器有限公司；恒溫水浴鍋HH-2，購于上海精宏有限公司；Tecan Infinite 200 PRO多功能酶標儀，購自瑞士帝肯公司。

1.3 精液的采集、冷凍與解凍

精液的采集稀釋與平衡、冷凍及解凍參照李丹丹等[5]的方法進行，如下。

1.3.1 精液的采集 精液采自廣西科達畜禽改良有限責任公司的健康、正常采精的杜洛克種公豬。常溫稀釋液與精液按體積比1∶1等溫稀釋后，0.5 h內運至廣西畜禽品種改良站實驗室進行后續試驗。選取鏡檢活力>0.8的精液用于后續試驗。

1.3.2 精液的稀釋與平衡 將鏡檢合格的精液室溫下離心(1 200 r/min，6 min)，棄上清；與稀釋Ⅰ液等體積混合。孵育后加入等體積的冷凍稀釋Ⅱ液(即精液∶稀釋Ⅰ液∶稀釋Ⅱ液 = 1∶1∶1)；用0.25 mL的塑料細管分裝，2 h內緩慢降溫到 4 ℃，并在該溫度下平衡2 h。

1.3.3 精液的冷凍 打開冷凍儀，使溫度從室溫降至4 ℃。精子平衡結束后檢測其活力，檢測合格后置程序降溫儀內，采用豬精液冷凍程序冷凍。程序結束穩定3 ～ 5 min后取出細管迅速分組置液氮罐中保存。

1.3.4 精液的解凍 迅速取出細管置60 ℃水浴復溫解凍5 s。擦干細管上的水珠并剪開其兩端，將精液倒出，與常溫等體積的BTS解凍液混合。

1.4 精子質量檢測

1.4.1 活率 參照王捷等[6]的方法，即從各試驗組中分別吸取精液20 μL于載玻片上，顯微鏡(400×)下觀察，計數約200個精子，計算運動精子數量，計算精子活率。

1.4.2 質膜完整率 用低滲腫脹法檢測精子質膜完整率，具體操作參照李丹丹等[5]的方法，即取果糖-檸檬酸鈉低滲溶液將解凍后的精子稀釋，并將精子密度調整為1×106mL-1， 37 ℃下孵育30 min后，取20 μL精子懸液置于血球計數板上，隨機選取400×普通光學顯微鏡下5個視野進行觀察，計數200個以上精子的質膜完整性。

1.4.3 頂體完整率與畸形率 參照楊寶衛[7]的方法操作，用考馬斯亮藍染色法檢測精子的頂體完整率和畸形率，取100 μL精子用1 mL 體積分數2%多聚甲醛溶液固定10 min，2 000 r/min離心5 min，用PBS離心洗2 次并去上清。取10 μL涂片，風干。把涂好的載玻片放人含有考馬斯亮藍的染液中，在37 ℃染色20 min。然后用蒸餾水沖洗，風干，最后在光學顯微鏡下觀察，每次計數200個以上精子，計算頂體完整率和精子畸形率。

1.4.4 精子MMP 調整精子濃度為1×106mL-1，于1 mL的PBS中900 r/min離心10 min，棄上清，重復3次。根據線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)說明書進行操作，涂片后用熒光顯微鏡觀察。

1.4.5 DNA損傷率 取適量精子懸液，按照精子懸液∶染液=19∶1的體積比混合，輕輕混勻，室溫避光染色15 min，涂片后熒光顯微鏡下觀察，計數并拍照，DNA損傷的精子數與精子總數的比值即為DNA損傷率。

1.5 抗氧化指標檢測

調整精子濃度為1×106mL-1，PBS清洗 3 次后重懸，裝載探針37 ℃培養箱孵育20 min后用熒光酶標儀檢測精子ROS水平。PBS清洗 3 次后重懸，加入裂解液超聲破碎，8 000 r/min低溫離心10 min，取上清測蛋白濃度，按照T-AOC檢測試劑盒說明書添加工作液，反應10 min后于波長593 nm下測定精子T-AOC。按MDA含量檢測試劑盒說明書添加工作液后煮沸30 min，冷卻后10 000 r/min常溫離心10 min，用酶標儀測定樣品在450 nm、532 nm和600 nm的吸光度，計算MDA含量。按SOD檢測試劑盒說明書添加工作液，37 ℃水浴30 min后在560 nm下檢測SOD活性。

1.6 糖代謝相關指標檢測

冷凍-解凍后，于1 mL的PBS中900 r/min離心10 min，棄上清，重復3 次，加入裂解液超聲破碎后檢測蛋白濃度，根據說明書添加工作液后用分光光度計分別在500 nm、340 nm和520 nm下檢測精子總膽固醇(TC)含量、HK活性和丙酮酸(PA)含量。

1.7 統計學處理

所有試驗均做3 次以上重復。數據以“平均數±標準差”表示，采用t-檢驗進行數據分析，P<0.05表示兩組比較具有顯著性差異；P<0.01 表示兩組比較具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 他克林對豬精子凍后質量的影響

如表1所示，凍融后他克林組精子活率、畸形率極顯著高于空白組(P<0.01)，質膜完整率、頂體完整率顯著高于對照組(P<0.05)，新鮮組的質量指標與兩個冷凍組的差異之間有統計學意義(P<0.01)。

表1 豬精子的凍后質量Table 1 Quality of boar sperm after frozen-thawed %

2.2 他克林對豬精子MMP的影響

400倍熒光顯微鏡下觀察豬精子線粒體膜電位，每次試驗不少于200 個精子(圖1)。綠色熒光精子說明MMP下降，并且該精子很可能處于凋亡早期。出現紅色熒光說明MMP比較正常，精子的狀態也比較正常。用發紅色熒光的精子百分率 (JC-1%) 代表MMP正常的精子比例。與新鮮組比較,他克林組和空白組的MMP水平均極顯著降低 (P<0.01)，空白組MMP水平與他克林組差異極顯著 (P<0.01) (圖2)。

2.3 他克林對豬精子DNA損傷的影響

精子DNA是評價精子功能的重要指標之一，在經歷冷凍和復蘇這種巨大的溫度變化之后精子結構會發生變化[8]，由于滲透壓的改變，胞內產生的過量活性氧易導致精子核DNA損傷[9]。如圖3所示，正常精子細胞核被均勻染成黃綠色熒光，DNA損傷的精子染色質濃縮，細胞核碎裂成點狀，被染成大小不一、致密濃染的綠色顆粒。在冷凍液中添加他克林來抑制冷凍-解凍對精子DNA的損傷，結果如圖4所示，精子冷凍保存會極顯著造成DNA損傷(P<0.01)，而他克林顯著降低DNA的損傷程度(P<0.05)。

2.4 他克林對豬精子抗氧化指標的影響

精子細胞內線粒體在精子代謝過程中產生大量ROS，活性氧自由基可引起精子膜上脂質過氧化，造成細胞損傷凋亡的同時還能對精子基因組造成傷害[10]，因此，總抗氧化能力是檢測精子的一項重要指標。結果(圖5)表明，新鮮組T-AOC極顯著高于兩個冷凍組(P<0.01)；相較于空白組，添加0.01 mmol/L的他克林能極顯著提高精子的 T-AOC(P<0.01)。

SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，其水平的高低間接反映機體清除自由基的能力，其活性能反映細胞的氧化狀態,也可常用來反映衰老死亡的直觀指標。本試驗發現(圖6)，冷凍保存的SOD活性精子會極顯著降低 (P<0.01)，而在冷凍稀釋液中加入適量濃度的他克林可顯著上調SOD活性，提高抗氧化能力(P<0.05)。

MDA是由機體內自由基于脂質形成過氧化反應的終末產物，能夠誘發核酸、蛋白質等生命大分子發生交聯聚合，具有細胞毒性，有促凋亡的作用，體內水平高低間接反應細胞受自由基攻擊的嚴重程度[11]。如圖7可知，2個冷凍組的MDA含量均高于新鮮組(P<0.01)，而他克林組MDA含量顯著低于空白組(P<0.05)。進一步證明他克林在精液冷凍保存中對抗氧化有正面影響。

2.5 他克林對豬精子糖代謝指標的影響

膽固醇作為細胞膜的重要成分，它還可以轉變為多種具有重要生理作用的物質，因此，膽固醇含量對維持精子代謝平衡是十分重要的。如圖8所示，與新鮮組相比，冷凍組總膽固醇含量均極顯著降低(P<0.01)，而在冷凍液中添加他克林可極顯著改善精子膽固醇含量降低的現象(P<0.01)。

葡萄糖在能量代謝和 ATP 的產生中發揮作用，HK為糖酵解過程中第一個調節酶，而糖酵解是精子維持精子活力、氧化磷酸化的主要途徑。本試驗對HK活性進行檢測，結果如圖9所示，兩個冷凍組與新鮮組相比HK活性均極顯著降低 (P<0.01)，他克林組與空白組相比HK活性顯著上調 (P<0.05)。

哺乳動物精子細胞內能量的來源是ATP，ATP為精子運動、蛋白質調控以及受精作用提供能量，丙酮酸是細胞糖代謝及體內多種物質相互轉化的重要中間體，其含量能間接反映糖代謝水平。如圖10所示，冷凍使精子總丙酮酸含量顯著(試驗組，P<0.05)或極顯著(對照組，P<0.01)降低，而冷凍液中添加他克林可極顯著逆轉精子丙酮酸含量降低的現象 (P<0.01)，可提高精子對葡萄糖的利用率，維持正常的生理功能和運動。

3 討 論

精液冷凍保存是目前畜牧業中最常用的生殖技術，是人工授精技術中極其重要的環節，可加快家畜和水產動物的新物種培育以及遺傳改良。使優良種公畜的精液能夠妥善保存，擴大精液使用范圍。但冷凍對精子活率、形態、精子膜和頂體完整性都會產生損傷及影響[12]。同時，精子經過冷凍這一過程會使其 DNA 片段受到損傷，從而影響胚胎的質量和生存能力[13]。冷刺激對豬精子帶來不可逆的損傷，可造成膜不穩定、膽固醇損失、膜流動性降低、膜通透性改變和滲透阻力降低，導致低溫猝倒、頂體反應和細胞凋亡，并導致精子成功受精的能力下降。膜膽固醇的喪失在細胞凋亡中起主要作用[14-17]。冷凍保存過程中，細胞內線粒體膜電位發生改變，誘導ROS產物產生，引起線粒體膜通透性改變，誘發細胞凋亡，從而造成細胞損傷[18]。氧化應激是由ROS或自由基引起的，精子維持正常生理功能離不開活性氧，ROS能促使精子發生頂體反應及獲能[19]。ROS是氧的代謝產物，過高濃度的ROS可以誘導細胞的脂類、蛋白和DNA氧化，對精子質量產生負面影響[20-22]，從而引起一系列的病理變化。

他克林自1993年開始運用于治療阿爾茲海默癥，是第一代可逆性抗膽堿酯酶抑制藥，可改善記憶能力降低，因其具有肝毒性在臨床中應用逐漸減少[23]。近年研究發現他克林可調控 K+和Ca2+通道[24-25]，是潛在治療體外寄生蟲藥物[26]，可抑制細胞凋亡、增加葡萄糖代謝，對神經細胞有保護作用[27-31]。本試驗通過在豬精液冷凍稀釋液中添加0.10 mmol/L他克林，檢測凍融后精子各項質量指標,結果顯示豬精液品質得到顯著提高,這表明他克林對冷凍保存的豬精子具有保護作用。結果顯示0.10 mmol/L他克林處理組的豬精子凍后活率高于冷凍空白組，與Hu等[2]在豬精液冷凍保存過程中添加他克林所得結果一致。他克林可減少冷凍-解凍過程中精子的死亡，從而提高豬精子凍后活率。Hu等[2]的研究中檢測了凍后的精子活率以及凍后精子的路徑速率、直線運動速率和軌跡速率等運動指標，本試驗在檢測凍后質量的基本指標后，從抗氧化和糖代謝方面進一步評價他克林對豬精子的保護作用，豐富其理論基礎及數據。近年研究顯示番茄紅素、丹參、枸杞多糖等多種藥物在精液保存中可減少氧化應激，提高精子質量[32-34]。張百芳等[35]研究發現雙他克林可有效減少嚴重缺氧、葡萄糖缺乏造成的細胞毒性，一定程度上說明他克林有增加細胞對葡萄糖利用的潛力，本試驗結果也顯示他克林可顯著提高精子糖代謝水平，其結果與張百芳等[35]研究結論一致，而其機制可能與他克林參與離子調控有關。

綜上所述，精液凍存會造成精子的損傷，降低精子活率和MMP，還可造成精子DNA損傷數增加，最終導致精子凋亡。當冷凍稀釋液中添加他克林，可有效增加質膜完整率、頂體完整率、MMP水平等表觀指標，還可以上調SOD活性和MDA含量，增加精子抗氧化能力，并且增加PA、TC含量和HK活性，促進精子對葡萄糖的利用。因此，0.1 mmol/L的他克林可以作為保護精子的有效成分應用到豬精液冷凍中，減緩精子的冷凍損傷，從而達到更佳的凍存效果。但他克林是否可以改善公豬冷凍精液的體外受精及人工授精能力，有待于進一步的研究。

4 結 論

在豬精液冷凍稀釋液中添加濃度為0.10 mmol/L的他克林可以提高精子的抗氧化能力和糖代謝水平，并改善凍融后豬精子的質量，試驗為探索他克林在豬精子冷凍中的作用提供了基礎數據，但其機制還有待深入研究。