低溫條件下日本醫蛭各組織基因表達轉錄組測序及qPCR驗證

余 米，諶穎蓮，曹 敏,2，周 夢，曾德軍

(1.重慶市藥物種植研究所,重慶 408435；2.特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室， 重慶 408435)

日本醫蛭(HirudonippnicaWhitman)為《中國藥典》收錄品種[1]，其含有高效抗凝血物質—水蛭素，同時具有抗血栓、抗凝、降血脂等功效，是心腦血管疾病藥物的主要動物原材料[2]。日本醫蛭的人工養殖是獲取日本醫蛭藥物原材料的主要途徑，但其人工繁殖是產業發展的瓶頸，解析日本醫蛭繁殖相關分子機理對提升其人工飼養效率及突破其人工繁殖瓶頸具有重要意義。溫度是影響日本醫蛭繁殖和生長的主要環境因子，不同溫度條件下日本醫蛭生理狀態存在明顯差異。日本醫蛭繁殖需要適宜的環境溫度，目前關于溫度對蛭類的影響研究僅限于繁殖性能和抗凍方面[3-5]，研究表明低溫能夠刺激寬體金線蛭的性腺發育[4]，但溫度對日本醫蛭的繁殖情況影響分子機制尚不明確，阻礙了對日本醫蛭繁殖相關分子機理的認知和應用。本研究通過設置不同的飼養溫度(18℃為日本醫蛭的繁殖適宜溫度，6℃為日本醫蛭的深層休眠溫度)，對日本醫蛭進行飼養，利用轉錄組測序[6]及實時熒光定量PCR技術檢測不同溫度梯度下日本醫蛭頭部、環帶和肌肉組織中的基因轉錄本的表達情況，對進一步了解日本醫蛭繁殖的分子機理，加速其人工繁育，提高生產力具有重要意義，同時挖掘出更多與繁殖相關的基因，為深入研究日本醫蛭的繁殖分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

40尾日本醫蛭來自重慶市藥物種植研究所日本醫蛭繁育基地，體質量為1.425～2.304 g，體長9.8～ 10.52 cm。分別置于6 ℃、18 ℃和 24 ℃恒溫培養箱內飼養30 d，剪取肌肉、環帶和頭部組織送北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序及分析。

1.2 試驗試劑

Trizol(大連寶日生物有限公司，貨號：9108)；反轉錄試劑盒(美國Thermo公司，貨號：K1682)；染料型熒光定量PCR Mix(大連寶日生物有限公司，貨號：RR820Q)；DL2000 Marker(大連寶日生物有限公司，貨號：3427Q)、2×Taq PCRMaster Mix(康為世紀生物有限公司，貨號：CW0690)；Goldview Ⅰ型核酸染料、異丙醇、無水乙醇、氯仿、瓊脂糖、熒光定量八連管等均由代理商購買。

1.3 RNA提取

取250 mg左右組織塊利用液氮研磨后轉至2 mL離心管中，加入1 mL Trizol冰上裂解5 min并搖勻，加入200 μL的氯仿，充分混勻后 12 000 r/min 離心15 min，將上清液轉移至1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，冰育 20 min，取出后10 000 r/min 離心10 min，去上清液并晾干，加入400 μL 75%無水乙醇洗滌，7 500 r/min 離心5 min后取出晾干，加入50 μL的DEPC水熔解，置于85 ℃水浴鍋內5 min后放置-80 ℃冰箱保存。

1.4 cDNA合成

取1 μg的RNA樣品利用DNA酶處理2 min后，75 ℃處理 5 min去酶活，加入多聚dT引物和隨機引物各1 mol/L(10 μmol/L)，65 ℃孵育5 min后加入dNTP、反轉錄酶、反應Buffer及滅菌水，42 ℃孵育1 h，75 ℃處理5 min去酶活，cDNA樣品保存于-20 ℃冰箱。

1.5 引物設計及qPCR反應

利用Primer 5軟件及NCBI數據庫序列對基因進行qPCR引物設計，詳細信息見表1，使用20 μL反應體系，包括10 μL Mix、上下游引物各1 mol/L(10 μmol/L)、cDNA模板1 μL、滅菌水 7 μL，置于PCR儀或熒光定量PCR儀反應；反應程序為：95 ℃預變性5 min 循環內95 ℃變性 30 s，60 ℃退火和延伸45 s，反應40 個循環；熔解曲線繪制程序為60 ℃ 穩定1 min，每5 s升高 0.5 ℃并記錄一次熒光值，至95 ℃結束，繪制熔解曲線圖，反應產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小并送樣測序檢測引物特異性。

表1 基因qPCR擴增引物序列及信息Table 1 Gene qPCR amplification primer sequence and information

通過設計的引物對各待測基因進行引物PCR擴增，檢測擴增反應的特異性，結果顯示各基因擴增反應條帶單一，未出現非特異擴增條帶，能夠用于qPCR反應來檢測各待測基因的表達情況(圖1)，同時各基因qPCR擴增熔解曲線峰單一(圖2)，PCR產物測序結果與預期一致，說明設計的qPCR引物能夠準確檢測各待測基因在各樣品中的表達情況。

1.6 蛋白功能域預測及miRNA親和預測

使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測假定蛋白包含的功能域，分析假定蛋白的功能；使用PSI-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對基因氨基酸序列；使用SWChen 2.0(https://ylchen-swchen.lofter.com/)分析非編碼RNA對miRNAs的結合情況。

1.7 統計分析

使用2-δδ算法[7-9]計算各基因在各組織中的相對表達情況；使用SPSS 23.0進行數據統計分析，兩組數據之間的比較使用Student-t檢驗，用“*”和“**”分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；多組數據之間的比較使用鄧肯法檢測，不含有相同大寫字母表示差異極顯著 (P<0.01)，不含有相同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)；利用Graph Pad 8.0繪制基因組織表達熱圖和柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序候選基因表達情況

通過對6 ℃、18 ℃、24 ℃ 3種不同溫度條件下飼養的日本醫蛭頭部、環帶和肌肉組織進行轉錄組測序，選取11 個在各條件下表達具有差異的基因繪制表達熱圖(圖3)并通過對基因序列比對進行功能注釋(表2)，結果顯示在 6 ℃條件下基因G1～G4，G7，G9，G11，G13，G14總體表達下調；G5，G6在總體表達上調；在18 ℃條件下G1、G2、G4、G7、G9、G13和G14在頭部組織表達相對較高，G6和G11在環帶表相對較高，G3和G5在肌肉組織表達相對較高；對11 個基因的功能進行注釋結果顯示，11個基因主要涉及肌球蛋白、無脊椎連接蛋白9以及一些假定蛋白和非特征蛋白。

表2 日本醫蛭基因功能注釋Table 2 Function note of H.nippnica gene

2.2 熒光定量PCR對待測基因表達驗證

為進一步驗證日本醫蛭在不同溫度條件下的基因表達的轉錄組測序結果，對6 ℃、18 ℃、 24 ℃ 3種溫度下日本醫蛭頭部、環帶、肌肉組織中的11 個待測基因進行實時熒光定量PCR擴增反應，檢測11個待測基因的表達情況(圖4～6)。結果顯示在6 ℃和24 ℃條件下飼養日本醫蛭 30 d后，在日本醫蛭肌肉組織中G1和G2基因在 6 ℃條件下的表達極顯著低于24 ℃條件下的表達(P<0.01)；在日本醫蛭頭部中6 ℃和24 ℃條件下G13基因表達差異不顯著(P>0.05)，G14基因在6 ℃條件下的表達極顯著低于24 ℃條件下的表達(P<0.01)；在日本醫蛭環帶中G4和G5基因6 ℃飼養條件下的表達顯著高于24 ℃飼養條件(P<0.05)，在6 ℃飼養條件下，G3基因在環帶中的表達顯著低于24 ℃飼養條件(P< 0.05)。在6 ℃、18 ℃和24 ℃飼養條件下，對G6、G7、G9、G11基因分別測定其在日本醫蛭的環帶和頭部的表情況(圖6)，結果顯示，在日本醫蛭的環帶中G6基因的表達隨著溫度的升高而極顯著降低(P<0.01)；而在日本醫蛭的頭部G7和G9基因隨溫度的升高呈現表達增高趨勢，其中G7在24 ℃飼養條件下極顯著高于18 ℃和6 ℃條件(P<0.01)，G9在18 ℃和24 ℃ 飼養條件下顯著高于6 ℃條件(P<0.05)，但G11基因隨溫度的升高表達呈現下降趨勢，其中24 ℃飼養條件下G11基因在頭部的表達極顯著低于6 ℃條件(P<0.01)。

2.3 假定蛋白功能域預測及非編碼RNA對miRNA親和預測

由于G2、G3、G6、G7、G9和G11的的注釋屬于假定蛋白，為進一步了解它們的功能，對以上6種測序序列進行開放閱讀框翻譯，將獲得的蛋白序列進行功能域預測了解6種假定蛋白可能有關的功能，結果顯示，僅有G6、G9和G11呈現出高置信度的功能域，包括G6和G9蛋白的跨膜結構域以及G11蛋白的核糖體功能域L31e(圖7)，暗示G6和G9可能為跨膜蛋白，而G11與核糖體蛋白相關，具體的功能判斷需要進一步分析，而G7沒有預測到相關功能域，其他置信度較低功能域已列出見表3，G13基因屬于沒有蛋白特征的序列，檢測其對miRNA的親和程度來預測其功能，列出親和排名前十位miRNA(圖 8)。

表3 編碼基因蛋白序列及功能域預測Table 3 Prediction of protein sequences and functional domains of coding genes

3 討 論

日本醫蛭俗稱水蛭、日本醫水蛭、稻田醫蛭，隸屬于醫蛭行亞目(Hirudiniformes Caballero)、醫蛭科(Hirudinidae Whitman)、醫蛭屬(Hirudo)，在中國南北多省均有分布，由于其含有高效抗凝血物質—水蛭素，是心腦血管疾病藥物的主要動物原材料[2,10]，近年來隨著中藥材市場和藥企需求的增加，過度捕撈加之天然水域水質的改變，使得天然水域日本醫蛭的資源量減少，日本醫蛭的人工繁育是獲取日本醫蛭原材料的主要途徑，而目前對日本醫蛭的繁殖機理研究尚屬空白，而日本醫蛭的繁殖需要在適宜的溫度條件下進行，因此掌握不同溫度梯度下日本醫蛭各基因的表達情況對于解析日本醫蛭的繁殖分子機理具有重要意義。

通過設置6 ℃、18 ℃、24 ℃ 3種溫度梯度的飼養條件，利用轉錄組學測序的方法對基因在日本醫蛭肌肉組織、環帶和頭部的表達差異進行測定，對其中表達差異的11個基因(表2)進行表達驗證，基因的組織表達轉錄組測序熱圖結果顯示，基因G1～G4和G7，G9，G11，G13，G14在低溫條件下總體表達下調，在低溫條件下變溫動物的代謝情況會相對變慢，基于低溫條件下表達量減少推測是代謝變慢造成[4,11]，而G5和G6在低溫條件下總體表達上調，暗示G5和G6基因可能為刺激日本醫蛭性腺發育的繁殖相關基因；18 ℃是日本醫蛭的最適繁殖溫度，在18 ℃飼養條件下不同組織中G1、G2、G4、G7、G9、G13和G14在頭部組織表達相對較高，G6和G11在環帶表相對較高，G3和G5在肌肉組織表達相對較高，日本醫蛭的頭部主要參與神經和體液的調控，因此在頭部組織高表達的基因可能涉及其繁殖調控，而環帶與日本醫蛭的繁殖具有較大的關聯，G6和G11的高表達暗示G6和G11基因與日本醫蛭的繁殖相關，日本醫蛭的肌肉組織能夠影響其活動和代謝狀況，反映機體的適應能力及對疾病的抵抗力，因此G3和G5可能與其適應性和疾病抗性相關；轉錄組學的表達測序結果為探究基因在不同組織及不同溫度條件下的表達情況及挖掘日本醫蛭繁殖相關分子，為研究日本醫蛭的繁殖分子機理提供參考[6]。為進一步驗證不同溫度下各基因的表達情況，利用實時熒光定量PCR試驗進一步驗證11個基因的表達情況(圖4～6)，結果顯示，低溫條件下G1、G2、G3、G14在肌肉、環帶和頭部組織中均表達下調，G4和G5在環帶中表達上調，低溫條件下基因的表達上調暗示G4和G5與日本醫蛭繁殖相關，同時G6基因在環帶中的表達情況隨溫度的升高而降低，與轉錄組測序結果一致，進一步暗示指出G6基因與日本醫蛭的繁殖密切相關；G7在頭部中6 ℃和18 ℃表達極顯著低于24 ℃，而6 ℃和18 ℃之間表達差異不明顯，且G11在頭部中的表達隨溫度的升高而降低，G11可能屬于繁殖促進基因，但需要進一步試驗驗證；G13在頭部低溫條件下表達變化差異不顯著，G9在頭部6 ℃和18 ℃之間表達差異顯著，但其他溫度比較不顯著，G9和G13的的功能還需要進一步實驗驗證，通過熒光定量對基因表達情況檢測結果指出G6基因在日本醫蛭的環帶中表達隨溫度的升高而降低，與轉錄組測序結果一致，指出了G6基因在日本醫蛭繁殖過程中的重要性，同時G4和G5在環帶中低溫條件下表達上調，也指明其繁殖關聯性，但與轉錄組測序結果不一致，需要進一步的試驗驗證，G11基因在頭部組織中低溫條件下表達上調，也暗示G11基因對日本醫蛭的繁殖具有促進作用，其他基因的功能需要進一步的試驗驗證。蛋白的功能域結構[12]與非編碼RNA對miRNA的親和能力情況能夠反映出未知蛋白和非編碼RNA序列可能的功能[8,13]，為進一步分析未注釋的G2、G3、G6、G7、G9、G11和G13基因，對其假定蛋白進行功能域預測和非編碼RNA序列進行miRNA親和能力評估，探究未注釋基因的功能情況[8,13]，結果顯示G6 和G9存在重復的轉膜域結構，G11具有一個核糖體蛋白域結構，可能由于物種之間的差異性，而其他假定蛋白沒有顯著的功能域結構，不顯著的功能域列于表3為其研究提供參考，假定蛋白功能域預測暗示G6和G9屬于膜蛋白，而G11與蛋白合成相關，為G6、G9和G11的功能研究提供參考，通過進一步的核酸和氨基酸BLAST比對發現，由于水蛭類物種序列數據核酸信息較少，物種之間的核酸序列差異較大，G6、G9和G11核酸序列與GeneBank比對相似度較低，通過蛋白PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)比較顯示，G6與脂肪酸去飽和酶(Omega-3 desaturase-like B[Platynereisdumerilii] ATV93525.1)具有較高的相似性，G9與水通道蛋白(Aquaporin [Eiseniaandrei] CAX48970.1)具有較高相似性，G11與核糖體蛋白(Ribosomal protein rpl31[Eurythoecomplanata] ABW23230.1)具有較高相似性，在特種生物高通量測序中，可通過序列比對的方法預測新基因的功能，但由于低等物種的多樣性及日本醫蛭序列信息的不完整，導致對基因的注釋不完整，PSI-BLAST比對可對保守的氨基酸序列區域給出評分而并非整個蛋白序列比對，能夠消除一部分由物種差異導致的非功能保守區域的不相識導致的低評分，但比對結果需要進一步試驗驗證，由比對結果可知，在低溫條件下水蛭可能增加G6脂肪酸去飽和酶的表達量來增加細胞脂膜磷脂脂肪酸鏈的不規則程度，增加細胞膜的流動性降低脂肪酸凝固點，有利于低溫環境下生存，同時去飽和酶的表達量升高也有較大幾率增加不飽和脂肪防酸的形成，有利于固醇類、甾類等性激素的合成；生物體內水分的變化能夠讓生物適應環境溫度的變化， G9基因在低溫條件下的平均表達量值減少(P>0.05)，能夠改變細胞水分含量，使其適應更為極端的低溫環境；低溫條件下生物的代謝活動會減少，G11為核糖體亞基的一部分，在低溫條件下表達量出現升高的狀況，可能與抗凍蛋白的合成相關，但具體需要進一步研究證明；非編碼RNA在細胞的繁殖調控中具有重要作用[14]，G13基因沒有蛋白的翻譯特征，屬于非編碼RNA序列[15]，非編碼RNA可通過親和miRNA來抑制miRNA對下游蛋白的表達調控，而影響動物的繁殖情況[13-14]，通過SWChen 2.0程序[8]預測G13基因對miRNA的親和程度和結合位置(圖8)，與miRNA親和程度較強的前十個miRNAs列于表3為其進一步研究提供參考。

4 結 論

通過熒光定量PCR檢測結果顯示，G4～G6基因在環帶中的表達隨溫度的升高而降低，與轉錄組測序結果一致，6 ℃條件下日本醫蛭基因 G4～G6表達量提高，G4～G6與繁殖具有較強的相關性。