基于16S rRNA高通量測序的野生和養殖多鱗白甲魚腸道微生物群落組成研究

茍妮娜,鐘明智，王開鋒

(1.陜西省動物研究所,陜西省秦嶺珍稀瀕危動物保育重點實驗室,西安 710032；2.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

多鱗白甲魚(Onychostomamacrolepis)又稱多鱗鏟頜魚，是一種雜食性淡水經濟魚類，隸屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鲃亞科(Barbinae)，白甲魚屬(Onychostoma)[1]。該魚常見于秦巴山區、鄂西山地及魯中南山地[2]，因其味道鮮美、營養豐富而深受消費者喜愛[3]。近年來，受氣候變化及水利工程影響，多鱗白甲魚野生資源量呈下降趨勢[4]，被《中國脊椎動物紅色名錄》評估為VU(易危)等級[5]。因此，具有重要的種質資源保護價值及人工養殖開發前景。隨著人工養殖技術的發展，多鱗白甲魚養殖規模逐漸擴大，然而各種疾病也隨之而來。抗生素類藥物拌料投喂以及化學試劑溶液浸浴是目前普遍采用的治療方法[6]，然而藥物療法不但污染水質，而且威脅水產品健康。因此，如何提高魚類自身免疫能力及抗病力成為近年來水產品健康養殖的研究熱點。有研究表明，腸道微生物菌群參與魚類營養[7]、免疫[8]和疾病爆發[9-10]等一系列生理過程。

動物的腸道由復雜的動態微生物生態系統組成，從營養、生理和病理學的角度來看，腸道微生物非常重要。腸道微生物菌群在宿主體內具有多種功能，通過促進營養供應、防止感染源寄居、能量穩態的維持和正常的粘膜免疫，它們對宿主的營養和健康的重要性在哺乳動物中已經得到很好證實[11-13]。魚類的腸道微生物通常來自周圍的水環境，土壤、沉積物以及飼料，這些微生物聚集在腸道中形成腸道微生物群落[14-18]。16S rRNA高通量測序技術打開了微生物研究的新思路，運用基因組學方法獲得的微生物數據信息比傳統的培養方法更加高效、準確。本研究通過宏基因組測序，探討野生和養殖多鱗白甲魚組成及其腸道微生物群落多樣性，以期為多鱗白甲魚的健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集樣本

2019年4月，分別于黑河多鱗白甲魚國家級水產種質資源保護區(33°58′38″N，108°08′54″E，陜西周至)和天源生態養殖公司(陜西鎮坪)采集野生和人工養殖多鱗白甲魚樣品。野外采用電捕法，養殖場采用撒網法捕魚。多鱗白甲魚生物學信息見表1。

表1 樣本生物學信息Table 1 Biological characteristics of samples

1.2 腸道內容物提取

分別將野生和養殖兩組參試魚(每組6尾，共12尾)在實驗室無菌條件下進行解剖。采用 0.9%生理鹽水沖洗魚體表面后，再使用蒸餾水進行漂洗。解剖后，將魚的腸道分離出來置于培養皿中，縱向剪開小腸，收集腸道內容物(3尾混合)，采用5 mL凍存管保存并標記后，立即放入液氮中冷凍，隨后置于-80 ℃ 超低溫冰箱中，備用。養殖樣品編號：養殖1(G-B-YANG)，養殖2(G-F-YANG)；野生樣品編號：野生1(G-K-YE)，野生2(G-I-YE)。

1.3 樣品的預處理

分別稱取0.25 g樣品，放入2 mL的無菌離心管中，采用OMEGA公司的試劑盒(E.Z.N.ATM磁結合土壤DNA試劑盒)提取DNA。

1.4 PCR檢測

利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒進行檢測，樣品DNA達到檢測要求后，委托上海生工生物工程有限公司進行腸道微生物16S rRNA V3、V4區宏基因組分類測序。引物序列為：341F:5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′, 805R:5′-GACTACHVGGGTATCT AATCC-3′。 PCR反應總體積為30 μL：Genomic DNA10～20 ng， Bar-PCR primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，2×Taqmaster Mix 15 μL，加入滅菌雙蒸水至30 μL。熱循環反應條件為：94 ℃ 變性3 min，94 ℃ 變性30 s，45 ℃ 退火20 s， 65 ℃ 延伸30 s， 5個循環； 94 ℃ 變性20 s， 55 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸30 s，20個循環；72 ℃ 5 min。PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳純化 回收。

1.5 統計分析

1.5.1 OUT分類分析 OTU (Operational Taxonomic Units) 指的是分類單元。先根據序列間的距離將全部樣本進行聚類，再按照序列間的相似性將樣本分成不同的 OUT。OTU的代表性序列為豐度最高的序列。

1.5.2 多樣性指數分析 腸道微生物菌群的多樣性和豐度情況可以通過幾種常見的多樣性指數進行評估，這些指標來源于生態學中評價環境微生物群落多樣性的方法。

群落多樣性指數：Shannon指數[19]，微生物多樣性指數之一，其數值越大，表明群落多樣性越高。Simpson指數[20]，與Shannon指數不同，Simpson指數數值越大，表明群落多樣性越低。覆蓋度，覆蓋率越高，表明樣本序列未被檢測出的概率越低，說明測序結果能夠反映樣本的真實 情況。

群落豐度指數：ACE指數[21]，用于估算微生物群落總OUT數，ACE 指數與微生物群落豐度呈正比。Chao1指數[22]，與ACE 指數類似，同樣用于估算群落微生物總OUT數。

1.5.3 物種分類學分析 對檢測樣本序列進行分類學分析，分別統計樣本在門(Phylum)、屬 (Genus)兩個分類層級水平的微生物群落組成。

1.5.4 PCA分析(主成分分析) 主成分分析[23]是一種數據簡化分析技術，在降低復雜數據維數的同時還保留數據中對方差貢獻最大的特征。樣本間距離越近，則表示這兩個樣本的組成越相似。

2 結果與分析

2.1 腸道微生物16S rRNA測序

測序后各樣本信息統計數據見表2和表3。從表2可知，各樣本質量控制后的序列平均長度在410～420 bp，表明樣品滿足高通量測序數據分析要求。通過Barcode對樣品序列進行質量控制，去除非特異性擴增序列及嵌合體，因此，從表3能夠發現，處理后各樣本的序列數小于處理前的序列數。

表2 樣本數據信息統計Table 2 Statistics data of samples sequencing

表3 去除嵌合體與靶區域外序列統計Table 3 Removal chimera and target out of sequence symbionts

2.2 腸道微生物OUT分布韋恩圖

不同樣品用不同顏色表示，圖中數字代表特異或共有的OTU數。韋恩圖構建所需樣本數一般為2～5個。如圖1所示，4個樣品腸道微生物OTU總數為8 252，養殖多鱗白甲魚腸道微生物的OUT數小于野生多鱗白甲魚。養殖1(G-B-YANG)和養殖2(G-F-YANG)的OUT數相差較小，分別為1 443和1 331，而野生1(G-K-YE)和野生2(G-I-YE)的OUT數相差較大，分別為 3 938和1 933。

2.3 腸道微生物群落多樣性指數分析

由表4可知，養殖1和養殖2的ACE和Chao1指數大于野生1和野生2，說明養殖多鱗白甲魚腸道微生物的物種豐度大于野生多鱗白甲魚。同時發現，野生2樣品腸道微生物群落Shannon 指數最大，而Simpson指數最小，表明該樣品生物多樣性最高。如表4所示，全部樣品的覆蓋度指數范圍在0.94～0.98，表明各樣品序列幾乎都被檢測出來，沒有被檢測出的概率很小。說明本試驗數據真實可靠，可以反映野生和養殖多鱗白甲魚腸道微生物群落組成的多樣性。

表4 樣本Alpha多樣性統計Table 4 Alpha indices of samples

隨機抽取檢測樣本序列，將抽取的序列數與其代表的OUT數形成稀釋曲線 (Rarefaction curve)(圖2)。曲線呈上升趨勢時，表明增加測序樣本數還能繼續產生新的OUT；而曲線趨于平坦時，則表明繼續增加檢測樣本也不會產生更多新的OUT，說明被檢測數據量較為合理。

2.4 腸道微生物群落物種分類

由表5可知，人工養殖的多鱗白甲魚腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和廣古菌門(Euryarchaeota)等菌門組成；野生多鱗白甲魚腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和衣原體門(Chlamydiae)等4個門組成。而在屬的分類水平上(表6)，人工養殖多鱗白甲魚腸道微生物中，優勢菌群為甲基桿菌屬(Methylobacterium)、埃希菌屬/志賀菌屬(Escherichia/Shigella)和乳桿菌屬(Lactobacillus)；野生多鱗白甲魚腸道中優勢菌群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)、支原體屬(Mycoplasma)和嗜衣原體屬(Chlamydophila)。

表5 基于門分類水平上各樣本腸道微生物優勢群落占比Table 5 Microbial dominant flora atphylum level %

表6 基于屬分類水平上各樣本腸道微生物優勢群落占比Table 6 Microbial dominant flora at gene level %

2.5 腸道微生物群落結構主成分分析

從圖3可以看出，野生1和野生2樣品出現在第一象限，而養殖1和養殖2 樣品是在第三象限，表明野生和養殖多鱗白甲魚的腸道微生物組成不同，二者之間存在明顯差異。

3 討 論

3.1 魚類腸道微生物組成及影響因素

多鱗白甲魚腸道菌群主要有變形菌門 (Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，這與Gajardo等[24]、Gatesoupe[25]和Saha等[26]的研究結果相似，說明細菌是魚類腸道微生物菌群的優勢群落。魚類的腸道微生物菌群組成受外源性和內源性因素的雙重影響，如食性、腸道結構、水環境溫度、養殖條件以及外界壓力等[27-28]。通過16S rRNA基因組測序研究發現，野生和人工培育的多鱗白甲魚腸道微生物菌群組成差異較大，且野生魚之間也存在一定差異，在孔雀魚(Trinidadianguppies)及褐點石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)的研究中也發現類似的結果[29-30]。可能是因為野生魚與人工養殖魚的攝食環境不同，食物結構具有差異。在野外，多鱗白甲魚常見于水流清澈、湍急，底質為礫石的山間溪流中，水體溶氧豐富，水質清潔度高。野生多鱗白甲魚以水生昆蟲、昆蟲幼體和附著在石塊上的藻類以及掉落水中的植物碎片等為食。人工培育主要使用土質池塘或水泥池，由于養殖成本和養殖環境條件制約，養殖密度較高，導致水體透明度降低，氨氮等代謝產物也會對水質產生一定程度的負面影響。人工養殖池塘中天然餌料匱乏，多鱗白甲魚主要攝食人工配合飼料。同時，受野外條件限制，野生魚類的攝食行為也不如人工飼喂的魚類規律，說明攝食條件和習慣對魚的腸道菌群組成有重要影響[31-33]。此外，野生魚與人工養殖多鱗白甲魚生活的水體環境不同，也會造成腸道微生物群落的不同。Giatsis 等[34]研究發現，羅非魚(Tilapia)腸道微生物群落與水體微生物組成具正相關性，表明魚類在適應環境過程中，腸道微生物具有積極作用。當各種不同的化學物質、抗生素、殺蟲劑、除草劑和殺蟲劑等污染物進入水生動物的消化道，它們可以極大地影響優勢腸道微生物群的組成，并可能導致個別物種從整個微生物群落中消失[35-37]。

3.2 魚類腸道微生物多樣性及作用

本研究中，野生多鱗白甲魚腸道微生物的OUT數大于養殖多鱗白甲魚。表明野生多鱗白甲魚腸道微生物群落豐度較大。可能是由于野外和人工培育的生境和攝食等方面的不同，導致魚類腸道微生物群落多樣性差異[38-39]。腸道微生物菌群在宿主營養和健康方面具有重要作用[40]。研究表明，魚類的腸道微生物通過產生與哺乳動物相似的維生素、氨基酸、消化酶和代謝物，參與宿主的營養和生理過程[41-43]。野生多鱗白甲魚腸道中優勢菌群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)，Tsuchiya等[44]研究發現鯨桿菌屬微生物可以合成維生素B12，維生素B12不僅促進核酸與蛋白質的生物合成，還參加碳水化合物、脂肪和蛋白質的分解代謝，是人和動物體內必不可少的微量元素。乳桿菌屬(Lactobacillus)是人工養殖多鱗白甲魚腸道微生物中的優勢菌群。研究發現，在人工培育系統中，乳桿菌屬(Lactobacillus)會發展成為鯉魚腸道微生物的優勢菌群并具有穩定性[45]，與本研究結果一致。這可能是由于乳桿菌可以提高魚類免疫力，從而更好的適應養殖環境。本研究表明，魚類腸道微生物菌群具有營養及調節消化道免疫功能的作用。然而，與恒溫動物相比，魚類的腸道生態環境復雜多變，因此，腸道微生物在魚類營養中的確切作用還有待進一步探究。