含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌檢測即用型質控樣品研制

張 濤，張 瑞，張雅倫，許苗苗，王 慧，陳 晨，周 巍,2,*，史國華,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050200；2.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050000）

含乳特殊醫學用途配方食品是指以生鮮牛（羊）乳及其制品為原料，經工業加工制備，滿足進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態人群對營養素或膳食特殊需要的乳制品，為特殊人群強化骨骼[1]、改善神經發育和認知功能[2]、增強免疫力[3]等提供營養物質。然而，含乳特殊醫學用途配方食品易被微生物污染，引起食物中毒，對人體健康造成嚴重危害，對社會造成不良影響[4]。在引起含乳特殊醫學用途配方食品中毒的食源性致病菌中沙門氏菌占比較大。沙門氏菌可引起傷寒、副傷寒、胃腸炎、敗血癥和局部感染等疾病[5-6]。現已發生多起含乳特殊醫學用途配方食品感染沙門氏菌引起的腹瀉中毒事件。2019年2月，法國公共衛生部門宣布在嬰幼兒米粉中檢測到沙門氏菌，造成26 名嬰幼兒中毒[7]。可見，沙門氏菌致病性強，是引起含乳特殊醫學用途配方食品中毒的重要致病菌[8-9]。

由于監督不嚴、檢驗體系不科學，造成食品安全問題不斷出現。目前，含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌的檢測方法主要有傳統血清分型檢驗、聚合酶鏈式反應技術[10-12]、免疫學檢測法[13]、近紅外技術及納米技術[14]。以上方法具有檢測周期長、操作繁瑣、結果判定誤差大等諸多弊端。因此，建立快速、有效的含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌檢驗方法具有重要意義。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年發展起來的用于病原微生物快速鑒定的一種方法[15-16]，可以實現對未知微生物的快速鑒定、分型、溯源等[17-19]。目前，MALDITOF-MS技術可以鑒定金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、宋內志賀菌、單增李斯特菌、大腸桿菌及厭氧菌，并取得較好的分析結果[20-24]。國內對基于MALDI-TOF-MS技術檢驗沙門氏菌陽性物質的研究較少，為更加便捷、快速檢測出含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌，本研究自制即用型沙門氏菌質控樣品，驗證該質控樣品在含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌檢驗中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙門氏菌標準菌株（CMCC 50959） 中國食品藥品檢定研究院。

無水乙醇、甲酸、乙腈（均為質譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司；質譜樣品處理基質 德國布魯克科技有限公司；TSA培養基 北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

MALDI-TOF/TOF 7090質譜儀 日本島津公司；MIR-254低溫恒溫培養箱 日本Sanyo公司；ME204電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15臺式離心機德國Sigma公司；VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 即用型沙門氏菌質控樣品制備及檢測

1.3.1.1 制備過程

在超純水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，質量濃度分別為15、8、5 g/100 mL，制得保護劑。將沙門氏菌標準菌株劃線接種于PCA培養基，36 ℃培養24 h；用無菌棉簽從平板上刮取菌苔放入生理鹽水中，混懸于凍干保護劑中，測得菌懸液麥氏濁度為2.5 MCF；向每個含有干燥劑的西林瓶中加滿液氮并滴加100 μL菌懸液，放入真空冷凍干燥機。待樣品充分干燥后取出，密封壓蓋冷藏。

1.3.1.2 計數方法

取出未開啟的凍干菌球瓶，放置至室溫，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟。將凍干菌球放入10 mL無菌水中，稀釋，傾注適量TSA培養基，放置于36 ℃培養箱24 h，計數。

1.3.1.3 MALDI-TOF-MS檢驗

取出未開啟的凍干菌球瓶，放置至室溫，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟；將菌球取出，放置于2 mL離心管，加入100 μL無菌水，振蕩1 min，12 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀中加入100 μL無菌水，重復離心3 次；離心所得沉淀中加入50 μL體積分數70%甲酸，振蕩2 min，再加入50 μL乙腈，振蕩2 min，吸取1 μL上清液滴到靶板上，室溫晾干后覆蓋1 μL基質，晾干，放入質譜儀。

在質荷比（m/z）2 000～20 000 Da進行檢測。根據MALDI-TOF-MS分析得出的特征性質譜圖分析沙門氏菌裂解后特異性蛋白質或多肽離子峰，實現區分和鑒定的目的。

1.3.2 質控樣品均勻性研究

隨機抽取沙門氏菌凍干標準樣品20 瓶，向每瓶標準樣品中加入1 mL生理鹽水，將凍干樣品充分溶解，使用全自動微生物螺旋加樣系統在E50模式下涂布于PCA平板，每個樣品做2 個平行。置于（36±1） ℃培養24 h，對結果進行統計分析，評價樣品的均勻性。

1.3.3 質控樣品穩定性研究

運輸條件模擬實驗：將沙門氏菌質控樣品分成2 份，其中一份放置于37 ℃培養箱，另一份放置于25 ℃培養箱，分別在貯藏0、1、3、5、7、14 d取出質控樣品，按照1.3.1.2節步驟計數，并作3 次平行實驗。

貯存條件模擬實驗：將沙門氏菌質控樣品分成2 份，其中一份放置于4 ℃冰箱，另一份放置于－20 ℃冰箱，分別在貯藏0、1、3、5、7、14、28 d取出質控樣品，按照1.3.1.2節步驟計數，并作3 次平行實驗。復蘇率按下式計算。

1.3.4 沙門氏菌質控樣品鑒定

將菌球放入25 g無菌乳粉中，按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》進行后續培養，用VITEK2 Compact全自動微生物分析系統鑒定。

1.4 數據處理

使用SSPS軟件，采用單因素方差分析對20 瓶沙門氏菌質控樣品均勻性檢測結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 即用型沙門氏菌質控樣品

本研究制得沙門氏菌質控樣品為白色圓球狀，西林瓶密封性良好，干燥劑未變色，水分去除完全，符合所需要求，可做為后續實驗樣品。

2.2 沙門氏菌質控樣品均勻性檢測結果

對20 瓶沙門氏菌質控樣品進行檢測。由表1可知，各樣品菌落數相差極小，平行性良好，各樣品間菌落數沒有明顯差異。

表1 20 瓶沙門氏菌標準物質稀釋10 倍計數結果Table 1 Counting results of 20 bottles of Salmonella standard

均勻性FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表2可知，根據SPSS軟件計算所得結果，F=0.804＜FINV（0.05，19，20）臨界值，表明在0.05顯著水平，該樣品符合均勻性的要求。

表2 沙門氏菌質控樣品均勻性實驗結果Table 2 Uniformity of Salmonella quality control samples

2.3 沙門氏菌質控樣品穩定性檢測結果

=3）Table 3 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated transport conditions (n = 3)表3 沙門氏菌質控樣品稀釋10 倍模擬運輸條件實驗結果（n

由表3可知，在37 ℃和25 ℃環境中，每個沙門氏菌質控樣品菌數相差較小，14 d內能保持良好穩定性。所以高溫環境可采用泡沫箱加冰袋運輸，常溫環境可直接運輸。

=3）Table 4 Stability of 10-fold diluted Salmonella quality control samples under simulated storage conditions (n = 3)表4 沙門氏菌質控樣品稀釋10 倍模擬貯存條件實驗結果（n

對沙門氏菌質控樣品進行－20 ℃和4 ℃貯藏穩定性實驗，實驗為期28 d。由表4可知，－20 ℃環境下貯藏28 d復蘇率為92.17%，沙門氏菌質控樣品穩定性良好，根據以往對沙門氏菌質控樣品的制備經驗，在－20 ℃條件下可以保存長達18 個月；4 ℃環境下，貯藏28 d復蘇率為90.43%，可以作為短期貯藏條件。

2.4 沙門氏菌質控樣品MALDI-TOF-MS檢測結果

驗證質控樣品低溫、長時間保藏后的作用效果。測得于－20 ℃貯藏0、14、28 d質控樣品的質譜圖，由圖1～3可知，比較3 次所得質譜圖可知，離子峰出現位置基本相同，信號穩定。沙門氏菌質控樣品變化極小，符合MALDI-TOF-MS質控樣品要求。

圖1 貯藏0 d沙門氏菌質控樣品質譜圖Fig. 1 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 0

圖2 貯藏14 d沙門氏菌質控樣品質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 14

圖3 貯藏28 d沙門氏菌質控樣品質譜圖Fig. 3 Mass spectrum of Salmonella quality control samples on day 28

2.5 沙門氏菌質控樣品生化鑒定結果

由表5可知，VITEK2 Compact全自動微生物分析系統測定結果為沙門氏菌，可信度為99%，表明沙門氏菌質控樣品未受污染，菌體未被破壞。

表5 沙門氏菌質控樣品生化反應鑒定結果Table 5 Biochemical identification results of Salmonella quality control samples

3 結 論

MALDI-TOF-MS鑒定是近幾年檢測微生物的新方法，彌補了傳統方法和基因型鑒定方法的不足，逐漸被各檢測機構認可和應用[25]。通過比較標準菌株圖譜得出結論，此方法操作便捷、結果直觀[26-27]。

本研究制得沙門氏菌質控樣品具有良好的均勻性，在模擬運輸穩定性及貯存穩定性中菌數變化較小，滿足日常運輸條件并具有較長有效期。對－20 ℃貯藏0、14、28 d的沙門氏菌質控樣品進行質譜檢測，結果顯示，質控樣品鑒定質譜圖相近，可作為日常實驗對照。綜上所述，MALDI-TOF-MS即用型質控樣品可為檢測含乳特殊醫學用途配方食品中沙門氏菌提供持續、有效的檢驗依據。