口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病疫苗聯(lián)合免疫臨床效果評(píng)估

劉國(guó)民，高日明，林文耀，宋慶慶，尚 策，王 凱，王景成

（金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

為探索口蹄疫（FMD）、豬瘟（CSF）、偽狂犬病（PR）3種疫苗聯(lián)合使用的可行性，切實(shí)提高基層免疫工作質(zhì)量，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少工作量，提高口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病免疫密度和免疫效果，降低動(dòng)物疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。孟麗軍等做了大量活疫苗與滅活疫苗聯(lián)合免疫方案的研究，疫苗接種操作時(shí)大部分用的是疫苗分點(diǎn)注射操作[2]。而在臨床上把相關(guān)疫苗先混合在一起，一次性免疫動(dòng)物體效果跟蹤報(bào)道較少，為了科學(xué)有效地研究聯(lián)合免疫方案可行性，研究驗(yàn)證口蹄疫滅活苗稀釋豬瘟、稀釋偽狂犬病凍干苗，對(duì)溶解后的豬瘟、偽狂犬病苗效價(jià)及物理性狀進(jìn)行了詳細(xì)的檢測(cè)分析，具體檢測(cè)項(xiàng)目：疫苗pH、半數(shù)細(xì)胞組織感染量（TCID50）、黏度、粒度、穩(wěn)定性以及對(duì)CSF、PR熒光定量PCR活性分析，從而為制定聯(lián)合免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 疫苗與試驗(yàn)豬只來源

口蹄疫滅活疫苗由金宇保靈生物藥品有限公司提供（商品名：金OA）批號(hào)：18392243；豬瘟ST傳代細(xì)胞苗由遼寧益康提供（商品名：瘟康）批號(hào)：201841；豬偽狂犬病耐熱保護(hù)劑C株苗由揚(yáng)州優(yōu)邦提供（商品名：偽狂寧）批號(hào)：18251003，上述疫苗均按各自說明書的要求進(jìn)行保存、運(yùn)輸。從廣西玉林選取后備母豬（1 000頭）、陸川選取經(jīng)產(chǎn)母豬（1 000頭）、桂林區(qū)域選取40日齡的保育豬（2 500頭）進(jìn)行此次試驗(yàn)，選取的各類豬只大小基本一致，采用人工投料，豬只自由采食，自由飲水。試驗(yàn)日期為2019年6月1日—2020年2月1日，地點(diǎn)廣西玉林、陸川、桂林區(qū)域的規(guī)模豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

口蹄疫O/A型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，由蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)2019122401；豬瘟ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，IDEXX公司產(chǎn)品，批號(hào)433220-P361；豬偽狂犬病gB抗體ELISA試劑盒（ADV-gB），由荷蘭BioChek百測(cè)公司提供，批號(hào)2331106；其他常規(guī)儀器均由國(guó)家獸用工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 疫苗稀釋與檢測(cè)

取2瓶豬瘟凍干苗，其中1瓶用20 mL口蹄疫滅活苗復(fù)溶，復(fù)溶后于室溫作用0 h、1 h、2 h，分別用MEM溶液作10倍系列稀釋進(jìn)行TCID50檢測(cè)；取3瓶豬偽狂犬病凍干苗，用10 mL口蹄疫滅活苗進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后于室溫作用0 h、1 h、2 h后分別用MEM溶液進(jìn)行10倍系列稀釋進(jìn)行TCID50檢測(cè)。

2 試驗(yàn)方案

2.1 聯(lián)合疫苗理化性檢驗(yàn)與疫苗活性評(píng)估

口蹄疫滅活苗稀釋豬瘟、豬偽狂犬病凍干苗，對(duì)溶解后的豬瘟、豬偽狂犬病凍干苗效價(jià)、物理性狀進(jìn)行了詳細(xì)的檢測(cè)分析,具體檢測(cè)疫苗pH、TCID50、黏度、粒度、穩(wěn)定性以及對(duì)CSF、PR 熒光定量PCR活性分析，從而為制定聯(lián)合免疫程序提供參考。

2.2 試驗(yàn)豬場(chǎng)安全性和有效性評(píng)估

將試驗(yàn)保育豬只分成5組， A組、B組、C組為單針對(duì)照組，其中A組豬只僅免疫CSF疫苗，B組豬只僅免疫PR疫苗，C組豬只僅免疫FMD疫苗；D組、E組為聯(lián)合免疫組，其中D組豬只免疫CSF+PR聯(lián)合混合疫苗，E組豬只免疫FMD+CSF+PR聯(lián)合混合疫苗。上述組別均需要在免疫前35日齡采血評(píng)估豬群抗體水平及健康程度，對(duì)40日齡保育豬一免后30 d、二免后30 d的免疫效果進(jìn)行跟蹤，免疫注射時(shí)給所有豬佩戴耳標(biāo)。試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫方案見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫方案

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 實(shí)驗(yàn)室評(píng)估物理性質(zhì)與疫苗活性

通過表2研究結(jié)果表明，用口蹄疫滅活苗復(fù)溶豬瘟、豬偽狂犬病凍干苗時(shí)，豬瘟凍干苗溶解較慢，基本在2～3 min后才能夠全部溶解，而豬偽狂犬病疫苗在1～2 min內(nèi)全部溶解；疫苗溶解后pH變化不大，基本在7.23～7.6之間；混合后的疫苗黏度在25.29～43.45 CP范圍內(nèi)；混合后的疫苗通過粒度檢測(cè)基本都是標(biāo)準(zhǔn)單峰，離心后沒有出現(xiàn)分層，對(duì)豬瘟、豬偽狂犬病通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒含量無顯著差異，說明使用口蹄疫滅活疫苗可以有效稀釋豬瘟、豬偽狂犬病疫苗，而且豬瘟、豬偽狂犬病疫苗活性不受影響。

表2 聯(lián)合疫苗理化性檢驗(yàn)與CSF、PRV熒光定量PCR疫苗活性檢測(cè)

3.2 臨床評(píng)估聯(lián)合免疫效果

3.2.1 免疫應(yīng)激反應(yīng)觀察

聯(lián)合免疫推廣區(qū)域豬只免疫后24 h內(nèi)個(gè)別區(qū)域有零星輕微應(yīng)激，現(xiàn)場(chǎng)通過物理?yè)尵群团R床處理均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，推廣區(qū)域的大部分豬只均未出現(xiàn)精神沉郁、飲食減退和死亡等異常免疫反應(yīng)情況，見表3。

表3 試驗(yàn)豬免疫副反應(yīng)情況

3.2.2 口蹄疫抗體指標(biāo)效果分析

通過表4和圖1可知，口蹄疫抗體水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，豬群?jiǎn)为?dú)免疫口蹄疫疫苗二次抗體水平與疫苗混合組（口蹄疫+豬瘟+豬偽狂犬病）抗體水平差異不明顯，說明單獨(dú)免疫效果與聯(lián)合免疫效果相當(dāng)，即聯(lián)合免疫組（口蹄疫+豬瘟+豬偽狂犬病）注入豬體后不影響口蹄疫免疫效果；通過一免后30 d，二免后30 d抗體數(shù)據(jù)分析可知，聯(lián)合免疫組與單獨(dú)免疫口蹄疫組，免疫持續(xù)期差異不顯著（P≥ 0.05），特別是聯(lián)合免疫組二免后30 d效果幾乎不受影響。

圖1 口蹄疫抗體比較

3.2.3 豬瘟抗體指標(biāo)效果分析

通過表4和圖2可知，豬瘟抗體分析可知，免疫前抗體水平與一免后30 d，二免后30 d差異不顯著，組間比較，各組之間差異不顯著（P＞0.05），說明聯(lián)合免疫組不影響豬瘟免疫效果。

圖2 豬瘟抗體比較

3.2.4 偽狂犬病抗體指標(biāo)效果分析

通過表4和圖3可知，對(duì)偽狂犬病抗體分析可知，聯(lián)合免疫組一免，二免后效果與免前gB抗體水平差異顯著（P＜0.05），說明免疫疫苗后偽狂犬病抗體快速提升，保護(hù)力提高。但從組間分析可知，聯(lián)合免疫組（免疫口蹄疫+豬瘟+豬偽狂犬病組）抗體水平好于單苗免疫組。

圖3 豬偽狂犬病gB抗體水平比較

4 討論

豬瘟、口蹄疫、豬藍(lán)耳病疫苗在同步免疫研究方面,國(guó)內(nèi)的科研人員進(jìn)行了較多的試驗(yàn)探索[3-4]，也取得了一些成功經(jīng)驗(yàn)。有些研究指出豬口蹄疫疫苗與豬瘟脾淋活疫苗可同時(shí)進(jìn)行免疫，而豬口蹄疫不能與高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗進(jìn)行同時(shí)免疫，3種疫苗不能同時(shí)免疫,存在相互干擾現(xiàn)象[5]。陸國(guó)林、陳偉杰等試驗(yàn)結(jié)論提出了豬瘟、豬口蹄疫和高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗可同時(shí)分點(diǎn)免疫,相關(guān)研究還有很多，結(jié)論各有爭(zhēng)論。

4.1 非洲豬瘟背景下，降低人豬接觸的重要性

在非洲豬瘟肆虐的背景下，做好口蹄疫，偽狂犬病，豬瘟的免疫防控可以有效提高豬群的健康，提高易感動(dòng)物的抵抗力，筑起抵抗非洲豬瘟的防線。有研究表明，相同感染劑量下，液體組和飼料組隨著暴露次數(shù)增加，非洲豬瘟的感染概率也隨之增加。當(dāng)液體組的暴露次數(shù)達(dá)到10次時(shí)，最低感染劑量1 TCID50的感染概率接近1。由此可見，減少免疫次數(shù)的同時(shí)減少人豬接觸的次數(shù)，降低針頭傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，大大降低非洲豬瘟感染的概率，多聯(lián)多價(jià)、組合免疫是未來豬場(chǎng)免疫程序變化的必然趨勢(shì)。

4.2 降低人豬接觸，構(gòu)建“一針多防”的組合免疫方案可行性

關(guān)于當(dāng)前形勢(shì)下的免疫重構(gòu)需要有新的考量，非洲豬瘟常態(tài)化下如何減少豬群的應(yīng)激，重構(gòu)豬群的免疫程序。鑒于此，結(jié)合金宇豐富可靠的產(chǎn)品，提出了“一針三防”的理念，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證及臨床應(yīng)用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于金宇產(chǎn)品線建立的“一針三防”效果非常理想。70日齡時(shí)免疫口蹄疫（口蹄疫首免），豬瘟（豬瘟二免），偽狂寧（偽狂犬病首次肌注）。同時(shí)設(shè)單個(gè)疫苗對(duì)照組，對(duì)比免疫前，免疫后30 d抗體的變化，評(píng)估方案的可行性。具體操作，用口蹄疫苗作為稀釋液稀釋偽狂寧，然后再稀釋豬瘟進(jìn)行免疫。通過方法創(chuàng)新形成口蹄疫-偽狂犬病-豬瘟三聯(lián)苗進(jìn)行一次注射免疫。

4.3 “一針三防”組合免疫的結(jié)果

通過口蹄疫抗體水平分析可知，單獨(dú)免疫效果與聯(lián)合免疫效果相當(dāng)，即聯(lián)合免疫組疫苗（口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病）注入豬體后不影響口蹄疫免疫效果，特別是聯(lián)合免疫組二免后30 d口蹄疫效果幾乎不受影響[6]。豬瘟抗體水平分析，免前抗體水平與一免后30 d、二免后30 d差異不顯著；各組之間比較差異不顯著，說明聯(lián)合免疫不影響豬瘟免疫效果。偽狂犬病抗體分析，聯(lián)合免疫組一免、二免后效果與免前差異顯著，說明免疫后偽狂犬病抗體快速提升，保護(hù)力提高。

綜上所述，3種疫苗同時(shí)免疫后，豬瘟苗和偽狂寧有免疫協(xié)同的作用，口蹄疫抗體無顯著差異，說明“一針三防”是可行的。聯(lián)苗共同刺激動(dòng)物的免疫器官后有提高免疫應(yīng)答的作用，口蹄疫疫苗的油佐劑兼具抗原緩慢釋放的同時(shí)有免疫增強(qiáng)的作用。但必須意識(shí)到，不同廠家生產(chǎn)的疫苗因其生產(chǎn)工藝、佐劑類型不同，組合免疫效果差異極大。此次研究是基于金宇產(chǎn)品的基礎(chǔ)上進(jìn)行的組合免疫應(yīng)用研究，請(qǐng)注意該方案的結(jié)論不適用于其他廠家的疫苗產(chǎn)品與金宇產(chǎn)品進(jìn)行組合免疫，同樣也不適用于其他廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行組合免疫。一針三防的好處口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病同時(shí)免疫不影響各自的免疫應(yīng)答，可以有效減少免疫次數(shù)，減少人和豬的接觸頻率，減少人工勞力，有效降低豬只的應(yīng)激，提高豬群抵抗力，70 日齡肌注免疫，隨著母源抗體的衰退，可以有效減少母源抗體的干擾，通過研究結(jié)論，能幫助廣大養(yǎng)殖戶，同時(shí)提供科學(xué)依據(jù)。