肝纖維化大鼠肝郁病證結合模型的建立與評價

李鑫 王權 陳思源 張逢 余曦明

摘要：目的 通過構建肝纖維化大鼠肝郁病證結合的模型，為相關研究提供模型參考依據和臨床治療提供診療思路。方法 將30只SD大鼠隨機分成2組，即空白組和模型組，每組15只。模型組大鼠每天定期皮下注射四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）+ 橄欖油，自第5周起每日加用夾尾進行刺激，每次30min，3次/天;空白組大鼠每天定期皮下注射橄欖油，2組均連續給藥8周。實驗結束后記錄動物和肝臟重量，收集肝臟組織制作石蠟切片染色后觀察其病理變化，用ELISA法檢測血清中AST和ALT相關活力指標。結果 （1）與空白組比較，模型組肝臟重量明顯增加（P<0.05），血清中AST和ALT的活力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。（2）形態學結果顯示：模型組大鼠肝臟出現了典型的肝纖維化病理改變，主要表現為肝組織內纖維結締組織增生，脂肪空泡形成及相關炎性細胞浸潤等。結論 采用此種方法造模可升高大鼠血清的AST和ALT活力，肝臟呈纖維化改變，成功建立了肝纖維化大鼠模型，是較為理想的造模方法。

關鍵詞：肝纖維化;大鼠;模型;肝功能

中圖分類號：R575 文獻標志碼：B 文章編號：1007-2349（2021）06-0066-04

【Abstract】Objective： To provide a model reference basis and clinical treatment ideas for related research by constructing a model combining liver depression and syndromes in rats with liver fibrosis. Methods： 30 SD rats were randomly divided into 2 groups， namely the blank group and the model group， 15 rats per group. The rats in the model group were given regular subcutaneous injections of carbon tetrachloride （CCL4） + olive oil every day， and starting from the 5th week， the tail clamp was added every day for stimulation， 30 minutes each time， 3 times a day. The rats in the blank group were given subcutaneous injection of olive oil every day. Both groups were given continuous administration for 8 weeks. After the experiment， the weight of the animals and liver was recorded. The liver tissues were collected to make paraffin sections and stained to observe the pathological changes. ELISA method was used to detect the AST and ALT related vitality indicators in the serum. Results： （1） Compared with that of the blank group， the liver weight of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the activity of AST and ALT in the serum was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. （2） The morphological results showed that the liver of the model group showed typical pathological changes of liver fibrosis， which were mainly manifested as the hyperplasia of fibrous connective tissue in the liver tissue， the formation of fatty vacuoles and the infiltration of related inflammatory cells. Conclusion： Modeling with this method can increase the activity of AST and ALT in rat serum， and the liver shows fibrotic changes. The successful establishment of a rat model of liver fibrosis is an ideal method for modeling.

【Key words】Liver fibrosis; Rat; Model; Liver Function

肝纖維化（1iver fibrosis，LF）是對各種慢性肝臟損傷的一種代償性反應，是“慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化”發展的中心環節。目前，肝纖維化的形成被認為是一個動態的過程，涉及復雜的細胞和分子機制，導致組織修復機制的慢性激活。如果慢性損傷持續存在，炎癥和纖維化可能發展成肝硬化，最終導致器官衰竭和死亡[1]。由此可見，肝纖維化是絕大多數慢性肝病的共同病理基礎，同時也是多種慢性肝病向肝硬化發展的共同病理組織學基礎。各種肝病多數經肝纖維化最后發展為晚期的肝硬化成為肝病死亡的主要原因。肝纖維化是嚴重威脅人類健康的疾病之一，但到目前為止，關于肝纖維化的治療方面，暫無理想的治療方法與治療策略，抗肝纖維化治療成了目前世界級醫學難題。針對此種情況，筆者及所在團隊設計通過采用大鼠皮下注射CCL4，并創新性的采用中醫肝郁病癥結合的干預方法，來構建能夠模擬人體肝纖維化甚至肝硬化過程的大鼠肝纖維化動物模型。通過檢測肝功能指標，HE和Masson染色來追蹤肝纖維化的發病進程，為相關實驗提供一種較為可靠的模型參考依據，同時對肝纖維化的早期診斷、藥物干預治療方面以及改善肝硬化病情和預后方面提供了良好的思路。

1 材料

1.1 實驗動物 選用SPF級SD大鼠30只，雌雄各半，140～160 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有公司，合格證號SCXK（湘）2016-0002，飼養在湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，許可證號SYXK（湘）2019-0009，環境溫度20～26℃，濕度40%～60%，每天光照10h，自由飲水，喂以顆粒飼料。

1.2 藥物及主要儀器 CCL4，500 mL，分析純，由廣東光華科技股份有限公司提供，批號：20181020;橄欖油由品渥食品有限公司提供;血清AST/ALT試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。

FA100L1電子天平：上海天平儀器總廠;TGL16型高速冷凍離心機：長沙英泰儀器有限公司;CElL-DYN3700型血液自動分析儀：美國 Avbbott.CO;KH2002半自動生化分析儀：濟南金浩峰技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組 將30只大鼠適應性喂養2天后，按照隨機數字表法分為2組：空白組和模型組，每組15只。

2.2 CCL4肝纖維化模型的建立 模型組：將CCL4與橄欖油按4∶6比例配成40%油劑，按0.3 mL/100 g劑量皮下注射，2次/周，持續8周;空白組：皮下注射橄欖油，2次/周，持續8周。

2.3 肝纖維化肝郁病證結合模型的建立 運用中醫“怒傷肝”中醫基礎理論，模型組第5周開始加用慢性夾尾激怒造模：用止血鉗夾住攻擊鼠的尾巴，每次刺激30 min，3次/d，令其與其它大鼠撕打以激怒全籠大鼠，持續至第8周。

2.4 指標測定 給藥8周后，戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，取肝組織稱重，計算肝臟指數（肝臟指數100%=肝臟濕重/末次體重×100%）。剪取各組相同部位組織置于4%的多聚甲醛進行固定，48h后脫水，石蠟包埋，切片厚度約5μm，烘片12h，肝組織病理變化采用HE染色觀察肝組織炎癥、細胞變性和肝纖維化情況，采用改良Masson染色判斷肝組織纖維增生情況。腹主動脈采血，分離血清，ELISA法檢測血清中肝功能指標ALT、AST的水平。

2.5 統計學方法 采用spss22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x2±s）表示。組間差異比較用單因素方差分析，方差齊性時，采用 LSD 方法進行組間多重比較;方差不齊時，采用 Dunnett's T3方法進行組間多重比較，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀態 空白組大鼠毛色有光澤，飲食飲水正常，活動正常，體質量逐漸增加，生長發育狀態良好且無死亡。模型組大鼠給藥后狀態逐漸轉差，并且隨著給藥時間的延長，精神萎靡，飲水減少，食欲下降，活動減少，被毛蓬亂無光，體質量減輕，給藥5周后開始出現個別死亡。

3.2 各組大鼠肝臟指數的水平比較 如表1所示：與空白組比較，模型組肝臟指數顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

3.3 各組大鼠血清肝功能指標活力的表達比較 大鼠的肝功能指標主要體現在AST和ALT活力的表達，如表2所示：與空白組比較，模型組的大鼠血清AST和ALT的活力水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

3.4 各組大鼠肝臟組織形態學的變化 肝組織HE染色顯示：空白組肝臟肝小葉結構完整，界限清晰;中央靜脈旁有放射狀排列的肝細胞索;肝細胞呈多邊形，邊界清晰，胞漿豐富;匯管區結構清晰（圖1）。模型組呈現出典型的肝纖維化表現，正常肝小葉結構破壞;肝細胞排列紊亂，有部分出現變性腫脹壞死;胞內有多量不規則的脂肪空泡形成，且中央靜脈周圍可見炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生，甚至形成纖維間隔和假小葉（圖2）。改良Masson染色顯示：空白組肝小葉結構清楚，未見到明顯肝纖維化表現（圖3）。模型組可見肝組織內膠原纖維數量增多，有較多的纖維間隔形成（圖4）。

4 討論

中醫學中并無肝纖維化的病名記載。根據其病癥，基本當屬于“脅痛”、“黃疸”、“鼓脹”等疾病范疇，而針對本病，中醫藥發揮多組分與多途徑的結合作用，取得了較好的臨床療效。多種動物實驗及藥物臨床試驗均表明，中醫藥在關于慢性肝病及抗肝纖維化的臨床療效評價、作用機制與物質基礎的研究等方面取得長足進步，并隨之出現一批抗肝纖維化的中藥新藥，初步建立中西結合抗肝纖維化診療指南，顯示中醫藥抗肝纖維化的治療優勢。但在肝纖維化動物模型方面仍沿用西醫的造模方法，采用單因素造模，模型具備肝纖維化病理條件，而無中醫證候特點，缺乏符合中醫基礎理論具有特異性、可靠性、重復性的動物模型的造模方法。目前，國內外建立肝纖維化大鼠模型的方法多種多樣，主要有以下幾種方法：（1）腹腔注射二甲基亞硝胺（dimethylnitrosaine，DMN）法：此種方法造模時間短，僅需要四周，動物死亡率低，纖維化形成穩定，但DMN是致癌物，實驗過程要特別注意個人防護[2]。（2）乙醇灌胃法：持續時間12周，模型簡單易行，肝纖維化病變率高，能系統觀察和研究酒精性肝病早期纖維化的動態變化，但缺點是造模時間長，會造成動物產生厭食[3]，消疲而死亡。（3）免疫造模法：主要是腹腔注射一種血清或蛋白（豬血清、血吸蟲血清、人或牛血清白蛋白等），每周2次，連續8周。該模型特點是很少引起肝細胞損傷，穩定性好，符合肝纖維化形成的慢性過程，且與人類肝纖維化的形成原因類似，適合長期慢性肝炎的臨床研究和免疫調控類藥物的篩選研究[4]。但該方法不能反映人體慢性肝炎發病機制中病毒反復復制持續攻擊人體的特點，與人肝纖維化的病理過程仍有很大差距。此外，該法模型復制時間長，動物致死率較高。（4）膽總管結扎法：該復制模型機制與人的繼發性膽源性肝硬化機制相吻合，主要是通過造成肝外膽管阻塞，導致膽汁淤積，造成肝內血管受壓，使肝細胞缺血、壞死。肝纖維增生延伸至膽管，包住肝小葉，引起肝纖維化。該法優點是操作簡單，模型復制時間短，炎癥反應輕，無毒，自發逆轉程度低，穩定性良好[5]。但缺點是致死率高、結扎后大鼠性情暴躁、厭水厭食，不宜復制長期模型。

本實驗創新性的根據五行理論，五志與五臟的對應關系，采用了“怒傷肝”的中醫理論做為基礎，并與西醫現代肝纖維化造模方法結合，建立新的符合中醫證候的肝郁且符合肝纖維化診斷標準的動物模型。實驗結果表明，模型組的肝臟指數、AST和ALT的活力均比空白組有明顯的升高，且肝臟組織病理特點與肝纖維化病理改變相似。我們認為，此種將肝纖維化疾病與中醫證候相結合的方法是成功的，既能成功復制出與西醫肝纖維化病理特征相一致，又能體現中醫證候特點的病癥結合動物模型，能夠為臨床診療提供良好的思路，值得進一步研究。

參考文獻：

[1]劉葉紅，陳娜，劉敏.P53與肝纖維化關系的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2013，21（4）：872-874.

[2]李生財，李彤.肝纖維化動物模型的造模原理及應用[J].中醫藥學刊，2006，24（12）：2267-2269.

[3]莫曉嵐，夏國園，周德磊.肝纖維化動物模型構建的研究[J].現代醫用影像學，2009，18（1）：43-45.

[4]王文萍，劉光煒，周語平.實驗性肝纖維化造模方法研究[J].實用中醫藥雜志，2012，28（4）：267-268.

[5]Lohwasser C，Neureiter D，Popov Y，et al.Role of thereceptor for advanced glycation end products in hepaticfibrosis[J].World J Gastroentero，2009，15（46）：5789-5798.

（收稿日期：2021-01-13）