UPLC- MS/MS 法測定岳陽黃茶中6 種農藥殘留

陳歷儒，易勁翔，江 帆，胡宇倩，唐 磊，龍一夫

（1.岳陽市農業綜合檢驗檢測中心，湖南 岳陽 414000；2.岳陽市農作物質量安全工程技術研究中心，湖南 岳陽 414000）

黃茶是我國特有的輕發酵茶，是由綠茶發展而來，特殊的“悶黃”工藝造就了其獨特的“干茶黃、湯色黃、葉底黃”和滋味甘醇的品質特征[1-2]。岳陽是中國黃茶之鄉[3]，出產的君山銀針是我國十大名茶之一，2019 年，岳陽黃茶產量已達8 017 t[4]，占全國黃茶總產量的60%以上，綜合產值達到50 億元。當地茶葉產業的壯大除了黃茶特有品質之外，質量安全也是影響產業發展的重要因素。為防治茶樹病蟲害，提高茶葉產量，施用農藥的種類和用量不斷增加，農藥殘留的隱患日益凸顯。目前針對黃茶的研究主要集中在品質[5-7]、加工工藝[8-11]等方面，對黃茶的農藥殘留及其檢測方法的探究罕有報導。在檢測多種農藥殘留時，色譜-質譜聯用方法已被廣泛應用于茶葉的質量安全檢測中，特別是UPLC- MS/MS 是測定多農殘的可靠、靈敏的方法[12]。因此，筆者在國家標準方法的基礎上[13]，探究岳陽黃茶中農藥殘留的基質效應，優化出一種高效便捷的UPLC- MS/MS 檢測方法，以期為岳陽黃茶質量安全監管和產業提質升級提供科學、準確的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃茶樣品由岳陽黃茶授權企業——華容縣勝峰茶葉有限公司提供。

主要儀器、耗材：超高效液相色譜三重四級桿串聯質譜儀（美國Waters 公司UPLC-Xevo TQD，配電噴霧離子源）；IKAT-25 勻漿機（德國艾卡公司）；CF-16RN 高速離心機（日立工機株式會社）；PL-E 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-5299 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Carbon/NH2小柱（waters, 1 g，6 mL；微孔濾膜（尼龍，13 mm×0.2 μm）。

農藥標準物質：多菌靈、氧樂果、啶蟲脒、吡蟲啉、甲拌磷、苯醚甲環唑均為100 mg/L，購于農業農村部環境保護科研監測所。

主要試劑：乙腈（Merck）、甲醇（Merck）、乙酸銨（Anaqua）、甲苯（TEDIA）均為色譜純。試驗用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配置 混合標準儲備液：取1 個10 mL 容量瓶，將濃度為100 mg/L 的6 種農藥標準品用甲醇定容配置成10 mg/L 的混合標準儲備液。

標準工作液：將混合標準儲備液采用逐級稀釋法分別用甲醇和黃茶基質凈化液配置成濃度為5、10、50、100、200、500 μg/L 的溶劑標準工作液和基質標準工作液。

1.2.2 基質效應評價 同一濃度下基質標準工作液和溶劑標準工作液的比值為絕對基質效應（AME），公式如下。

絕對基質效應（%）= 基質標準工作液峰面積/溶劑標準工作液峰面積×100

當AME ＞100 %時，表明該基質為增強效應，AME ＜100 %時，該基質為抑制效應。當|AME-1|≤20 %時，其數值在誤差范圍之內，認為該基質沒有基質效應，若20 %＜|AME-1|＜50 %，則為中等基質效應，|AME-1|≥50 %，則為強基質效應[14-15]。

1.2.3 樣品前處理 （1）制樣：茶葉樣品為日常檢測中獲得的不含這6 種農藥的空白黃茶樣品，樣品于不銹鋼粉碎機中粉碎，混勻過40目篩網并裝于密封袋中，于-25℃條件下備用。（2）提取：準確稱取5.00 g 已制備黃茶樣品于100 mL 離心管中，加入10 mL 蒸餾水浸透，密封1 h 后，加入30 mL 乙腈，10 000 r/min勻漿提取1 min，加入氯化鈉約3 g，再次勻漿1 min，置于高速離心機中4 000 r/min 離心5 min。（3）凈化：移取4 mL 上清液于已預淋洗的Carbon/NH2柱上，用12 mL 乙腈與甲苯混合溶液（體積比為3 ∶1）分3 次洗脫凈化柱，收集全部濾液于雞心瓶中，45℃水浴旋轉濃縮至近干，用甲醇定容至4 mL，過0.22 μm 微孔濾膜后待測。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱：Waters C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，進樣量1 μL。流動相A：水；流動相B：0.5 mmol/L 乙酸銨（含1%甲酸）；流動相C：甲醇。梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜洗脫條件參數

1.2.5 質譜條件 采用多反應監測模式（MRM），電噴霧離子源為ESI+，毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量100 L/h，脫溶劑氣流量750 L/h。

1.2.6 添加回收與基質標準曲線 以黃茶為空白樣品，在0.01、0.05、0.10 mg/kg 這3 個水平下對6 種農藥進行添加回收試驗，每個水平5 個重復，考察檢測分析方法的準確性和可靠程度。測定以黃茶基質凈化液配置的 5、10、50、100、200、500 μg/L 系列混標，以添加農藥標準品的質量濃度（μg/L）為橫坐標，相對應的定量離子對響應值為縱坐標繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

目前茶葉農殘檢測利用固相萃取的前處理方法中，分為提取和凈化2 部分，經查閱文獻可知[16]，純乙腈較不同濃度的乙腈水溶液有更好的提取效果，因此，試驗采用乙腈為提取劑；在提取液凈化時，Florlisil 柱[17]、Carbon/NH2柱[18]和Cleanert-Florisil 固相萃取柱[19]效果較好，考慮到黃茶的成分復雜、色素過多，選擇含有石墨化碳的Carbon/NH2柱作為凈化柱，能夠準確高效萃取出目標農藥。

2.2 儀器參數優化

在正離子模式下分別對0.4 mg/L 的6 種農藥標準溶液進行母離子全掃描，確定穩定的母離子。再進行子離子掃描，篩選響應值較高、干擾較小的2 個離子作為子離子，信號較高的離子作為定量離子，并優化錐孔電壓和碰撞能量。最后在多反應監測（MRM）模式下達到最佳監測條件，詳見表2。

表2 6 種農藥質譜參數

2.3 基質效應分析

3 個濃度水平下的6 種農藥在黃茶中的絕對基質效應均小于100 %（圖1），參照 1.2.2 節中的評價方法，表明該基質對6 種農藥均存在抑制現象；多菌靈和氧樂果在3 個濃度水平下的AME 為80.53%～97.67%，認為沒有基質效應；吡蟲啉和啶蟲脒的AME 在22.33%～38.20%，屬于強基質抑制效應；苯醚甲環唑和甲拌磷的AME 在59.33%～78.43%，屬于中等基質抑制效應。3 個濃度水平下的6 種農藥，其AME 的RSD 在0.57%～7.40%，分析結果精確可靠。

圖1 6 種農藥在黃茶中的基質效應

2.4 方法驗證分析

2.4.1 基質標液線性范圍 參照1.2.6 計算目標農藥的基質標液線性方程，相關結果見表3。6 種農藥在范圍5～500 μg/L 內呈良好的線性關系，相關系數為0.998 8～0.999 9，根據6 種農藥在該儀器的響應值，以10 倍信噪比（S/N=10）計算定量限。結果顯示，吡蟲啉、多菌靈、苯醚甲環唑、啶蟲脒、甲拌磷、氧樂果的定量限分別為1.0、0.1、0.3、0.3、0.4、1.0 μg/kg，均遠低于最大殘留限量500、5 000、10 000、10 000、10 000、50 μg/kg，表明該方法可對這6 種農藥進行準確定性、定量分析。

表3 6 種農藥的標準曲線、相關系數、線性范圍和定量限

2.4.2 農藥總離子流色譜圖 在1.2.4 的色譜條件下，6 種農藥基質混合標液（濃度為100 μg/L）的總離子流色譜圖如圖2所示。出峰順序依次為氧樂果、吡蟲啉、啶蟲脒、多菌靈、苯醚甲環唑和甲拌磷。色譜圖峰形良好，無雜質干擾，均得到較好的分離。

圖2 100 μg/L 水平下6 種農藥基質混合標準溶液的LC-MS/MS 色譜圖

2.4.3 回收率和精密度 在黃茶中添加6 種農藥進行加標回收試驗，每個添加濃度重復5 次，結果見表4。3 個添加水平下6 種農藥的平均加標回收率在77.17%～101.28%，RSD 在0.97%～9.97%，滿足黃茶中6 種農藥殘留量的定性定量分析要求。除苯醚甲環唑和啶蟲脒外，4 種農藥的加標回收率隨添加濃度的增大而降低。

表4 6 種農藥在黃茶中的加標回收率、相對標準偏差（n=5）

3 結論與討論

試驗對岳陽黃茶中的吡蟲啉、多菌靈、苯醚甲環唑、啶蟲脒、甲拌磷、氧樂果進行定性、定量檢測，其線性關系、回收率、精確度均符合要求，具有較好的準確性和重現性，該試驗方法簡便快速、靈敏度高、適宜于大批量檢測，可廣泛應用于檢測岳陽黃茶中6種農藥的殘留量。

在國標檢測茶葉方法的基礎上[13]，探究建立一種高效便捷的利用超高效液相色譜串聯質譜測定岳陽黃茶中6 種農藥殘留量的分析方法，并對分析方法的準確性和穩定性進行驗證。該研究減少了乙腈提取次數，簡化了凈化流程，確定了以乙腈為提取劑，Carbon/NH2柱為凈化柱，UPLC-MS/MS 檢測的方法。

對于流動相的選擇，前人研究中各有不同，乙腈-水[20]、甲醇-水[15]、乙酸銨-乙腈[14]、乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）-甲醇[21]是常見的流動相組合，經過反復試驗，探究不同流動相組合對目標農藥分離度、峰形的影響，最終確定了甲醇-乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）-水的組合。

不同種類茶對目標農藥檢測的基質效應各有差異。在青錢柳茶的農藥殘留檢測中，啶蟲脒和吡蟲啉的基質效應為中等基質抑制效應[15]，杜仲茶中啶蟲脒為弱基質抑制效應，吡蟲啉為中等基質抑制效應[22]，綠茶中氧樂果的基質效應為中等基質抑制效應[23]，這與該試驗中黃茶對目標農藥的基質效應存在差異，其主要原因在于茶葉基質的不同，可見，探究岳陽黃茶中農藥殘留的分析方法非常必要。