牛乳、驢乳乳清蛋白二級結構及其功能對比研究

劉愛成，李墨翰，張正翰，張秀敏，劉一鳴，陳佳麗，熱罕古麗，鄭 艷，岳喜慶,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.北京食品科學研究院，北京 100068；3.沈陽農業大學外語教學部，遼寧 沈陽 110866）

驢乳是一種特種乳，其基本組成與人乳較為相近。驢乳中乳清蛋白相對含量較高，VC含量豐富，鈣磷含量超過人乳[1]；驢乳脂肪含量較低，脂肪酸組成豐富，營養價值高，亞麻酸和亞油酸含量高于牛乳和羊乳[2]；驢乳中活性成分較多，如溶菌酶和乳鐵蛋白等，具有增強免疫力、消除炎癥等作用，適合多類人群食用及多種配方食品的生產，具有較大的開發潛力[3-5]。牛乳營養價值豐富，受眾范圍廣，占據了乳類消費市場的絕大多數份額[6]。牛乳中乳糖、蛋白質和脂肪含量較高，可以為人體提供能量[7]，牛乳中的α-乳白蛋白能為人體提供重要的必需氨基酸，對嬰幼兒的成長發育極為重要[8]。目前嬰幼兒配方乳粉多用牛乳作為基料，但是由于一部分嬰幼兒對牛乳蛋白過敏，會產生一些不良反應[9]，所以驢乳受到人們的關注，并逐漸被用于嬰幼兒配方食品的生產。在國外，驢乳被用于治療牛乳蛋白過敏癥狀，并且取得了較好的療效，因此驢乳也被稱為“低致敏性”乳[10]。

新生兒的能量補充來自蛋白質、碳水化合物和脂質等，蛋白質能夠補充營養及發揮功能作用，促進生長發育[11]。乳清蛋白易于消化吸收，營養價值高，適合作為嬰幼兒配方食品基料，如通過添加乳清蛋白調整蛋白比例，使嬰幼兒配方乳粉的組成更接近母乳[12-13]。α-螺旋和β-折疊是蛋白質中常見的二級結構[14]，每種結構都具有一定的功能，其中α-螺旋結構十分穩定，能夠作為識別基序，介導蛋白質間相互作用[15]。傅里葉變換紅外光譜法、核磁共振技術、圓二色光譜法等是目前較為常用的測定蛋白質二級結構的技術[16]。在上述方法中，傅里葉變換紅外光譜法因其適用性強，能在多種環境下對蛋白質等生物大分子進行定量分析從而被廣泛使用。近年來，國內外對牛乳和驢乳組成成分和營養價值研究較多，但對于牛乳和驢乳蛋白質二級結構及其蛋白質功能的對比分析較少。

本研究首先通過傅里葉變換紅外光譜分析驢初乳、驢常乳、牛初乳、牛常乳乳清蛋白的二級結構，通過OMNIC 8.2和Peakfit 4.12軟件分析譜圖，隨后利用液相色譜-質譜聯用技術對上述4 種乳樣的乳清蛋白進行鑒定，并進一步利用基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）代謝通路分析其功能及差異。比較上述4 種乳樣中乳清蛋白二級結構及功能性質的差異，將有助于加深對不同乳源及不同泌乳期乳清蛋白成分的認識，為開發更適合嬰幼兒需求的配方乳粉提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳、牛常乳采自沈陽沈北新區伊利牧場，驢初乳、驢常乳采自大連圣鴻道荙驢業科技發展有限公司養殖場，其中初乳采集時間均為分娩后0～7 d，常乳均為分娩后30～60 d。上述4 種乳樣各采集30 份，于超低溫冰箱（－80 ℃）貯存待用，在實驗前解凍并將同種乳樣充分混合，以排除個體差異[17]。

1.2 儀器與設備

FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀 蘇州貝銳儀器科技有限公司；5804R多功能臺式離心機 德國艾本德股份公司；Q-Exactive質譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；UniStar 2真空冷凍干燥機 北京天利聯合有限公司；1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀、強陽離子交換色譜（SCX）柱 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白二級結構測定

1.3.1.1 樣品前處理

每組稱取30 mL乳樣進行離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min），除去上層脂質；隨后將樣品再次離心（4 ℃、12 000 r/min、60 min），使用低溫丙酮法對上清液進行處理，除去酪蛋白，再將上清液凍干，制成乳清蛋白凍干粉[18]。

1.3.1.2 傅里葉變換紅外光譜圖分析

傅里葉變換紅外光譜檢測前將凍干樣品通過溴化鉀壓片法制樣，制樣后使用衰減全反射全范圍掃描。通過OMNIC 8.2軟件對樣品譜圖的酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm－1）和酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm－1）進行處理，再使用Peakfit 4.12軟件對所得的曲線進行最終的處理分析，確定各子峰對應的二級結構，根據峰面積求出相對含量。

式中：X為二級結構相對含量/%；A為各二級結構的峰面積；ΣA為各二級結構峰面積總和。

1.3.2 蛋白質功能測定

參考張熙桐等[19]的處理方法，提取乳清蛋白后，使用過濾輔助蛋白質組制備法進行酶解，隨后采用毛細管高效液相色譜與電噴霧質譜法對蛋白進行鑒定。再利用GO功能注釋及KEGG代謝通路對乳清蛋白的生物學功能及參與的代謝通路進行分析。

1.4 數據處理

所有實驗均至少重復3 次，數據以平均值±標準差的形式表示，選用SPSS（version 22.0）統計分析軟件及Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白二級結構分析

圖2 驢初乳（A）、驢常乳（B）、牛初乳（C）和牛常乳（D）乳清蛋白酰胺Ⅰ帶擬合效果Fig. 2 Amide I band curve-fitting results for whey proteins in donkey colostrum (A), donkey milk (B), bovine colostrum (C) and bovine milk (D)

表1 驢初乳、驢常乳、牛初乳和牛常乳乳清蛋白酰胺Ⅰ帶分析結果Table 1 Secondary structure contents of whey proteins in donkey colostrum, donkey milk, bovine colostrum and bovine milk determined from amide I band

由圖1可知，4 種乳樣光譜圖的變化規律大致相似，將4 種乳樣原譜圖通過OMNIC 8.2軟件和Peakfit 4.12軟件進行處理（圖2），對酰胺Ⅰ帶進行分析，得出每種乳樣的二級結構及對應的相對含量（表1），為更好區分某些二級結構基序及更準確定量，對酰胺Ⅲ帶進行分析[20]（表2）。分析結果顯示，驢乳和牛乳乳清蛋白二級結構存在差異。驢乳乳清蛋白中α-螺旋及β-折疊相對含量均高于同期牛乳，而β-轉角相對含量則低于牛乳。與牛初乳相比，牛常乳乳清蛋白中的二級結構相對含量均降低；與驢初乳相比，驢常乳中β-折疊結構相對含量降低而α-螺旋結構相對含量升高。驢乳中β-折疊結構相對含量較高，研究發現，乳中含有的纈氨酸和異亮氨酸能促進β-折疊結構的形成，同時，驢乳中所含的脯氨酸也有利于β-轉角結構的形成[21]。而β-轉角結構過多會導致α-螺旋結構相對含量降低，間接影響人體吸收利用，驢常乳乳清蛋白中α-螺旋結構相對含量最高，β-轉角結構相對含量最低，因此最適于人體吸收。

表2 驢初乳、驢常乳、牛初乳和牛常乳乳清蛋白酰胺Ⅲ帶分析結果Table 2 Secondary structure contents of whey proteins in donkey colostrum, donkey milk, bovine colostrum and bovine milk determined from amide III band

蛋白質變性后，二級結構中的α-螺旋會發生轉變，從而導致β-折疊和β-轉角結構含量增加[22]。由于驢乳和牛乳在不同泌乳期的成分存在一定的差異，如驢乳中的蛋白質含量在泌乳期有先降低后穩定上升的趨勢[23]，因此也可能導致驢乳乳清蛋白二級結構的變化。

2.2 乳清蛋白GO功能注釋分析

2.2.1 參與的生物過程分析

圖3 4 種乳乳清蛋白參與的生物過程Fig. 3 Biological processes involving whey proteins in four milks

由圖3可知，4 種乳樣乳清蛋白參與的主要生物過程包括代謝過程、對刺激的反應、定位及免疫系統過程等，其中參與代謝過程的乳清蛋白種類數最多，其次為參與對刺激的反應過程的乳清蛋白種類數較多。在上述4 種乳樣的乳清蛋白中，驢常乳中參與生物過程的乳清蛋白種類數最多，其次是驢初乳，牛常乳與牛初乳差別不大。整體來看，牛乳中參與生物過程的乳清蛋白種類數均低于驢乳，隨著泌乳期的延長，驢乳和牛乳參與生物過程的乳清蛋白種類數均增加，但牛乳增加幅度不大。因此，相較于牛乳，驢乳在生物功能方面更具優勢。由于嬰幼兒的免疫力較低，相較于牛乳，驢乳能更好地增強免疫力，所以配方乳粉可以使用驢乳為基料進行研發，刺激嬰幼兒腸道菌群生成，增強腸道功能，促進免疫系統發育[24-25]。良好的應激反應也有利于嬰幼兒適應外界環境，維持機體穩定。驢常乳在各過程中參與的乳清蛋白種類數均最多，發揮的作用最明顯，說明驢常乳相較于牛乳及驢初乳在生物功能方面更具優勢。

2.2.2 分子功能分析

圖4 4 種乳乳清蛋白參與的分子功能Fig. 4 Molecular functions involving whey proteins in four milks

由圖4可知，調節作用是4 種乳樣的乳清蛋白參與最多的分子功能，其次是酶調節活性、脂質結合作用、抗氧化活性和轉運活性等。整體而言，4 種乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數存在一定的差距，除轉運活性外，牛乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數均少于驢乳；隨著泌乳期的延長，除抗氧化活性外，牛乳和驢乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數均增加；驢乳中參與調節作用和酶調節活性的乳清蛋白種類數較多，且高于牛乳，目前已有研究表明，驢乳能夠調節胰島B細胞活力及與糖代謝有關酶的活性，對治療2型糖尿病具有重要作用[26]。蘇德奇等[27]的研究也證明了驢乳的抗氧化功效，能夠對機體損傷部位產生一定的保護作用。驢常乳除參與轉運活性的乳清蛋白種類數低于牛常乳，參與其余分子功能的乳清蛋白種類數均最多，相較于牛乳和驢初乳，驢常乳在分子功能上發揮的作用更明顯。

2.2.3 細胞組成分析

由圖5可知，驢乳與牛乳乳清蛋白主要參與的細胞組成有胞外區部分、細胞器、胞外體、胞囊等，驢乳和牛乳中參與胞外區的乳清蛋白種類數最多。在血液微粒組成上牛乳和驢乳參與的乳清蛋白種類數差距較小。整體而言，驢常乳乳清蛋白參與細胞組成的乳清蛋白種類數最多，驢初乳次之，牛初乳最少。隨著泌乳期的延長，驢乳和牛乳乳清蛋白參與細胞組成的乳清蛋白種類數逐漸增多，驢乳增加幅度較大，牛乳增加幅度較小。胞外區和細胞器區是細胞組成中2 個主要區域，很多細胞激活反應及分子結合均發生在胞外區。膜性細胞器是一種相對局域化的空間結構，由膜包裹，在機體內有序行使細胞分裂、增殖、呼吸作用等生物學功能[28]。牛乳乳清蛋白參與細胞組成的乳清蛋白種類數與驢乳乳清蛋白存在明顯差距，由此可見，驢常乳更有助于促進嬰幼兒機體內的細胞組成，且很大程度上優于牛乳。

圖5 4 種乳乳清蛋白參與的細胞組成Fig. 5 Cellular components involving whey proteins in four milks

2.3 4 種乳乳清蛋白參與的KEGG通路分析

表3 4 種乳乳清蛋白參與KEGG通路種類數Table 3 Number of KEGG pathways involving whey proteins in four milks

由表3可知，通過KEGG通路分析得出，驢乳乳清蛋白參與的KEGG通路數量多于牛乳，驢初乳、驢常乳乳清蛋白分別參與17、28 條KEGG代謝通路，而牛初乳、牛常乳則分別參與3、10 條KEGG代謝通路。隨著泌乳時間的延長，牛乳和驢乳乳清蛋白參與的KEGG通路數量均增加，4 種乳存在3 條共同的KEGG通路，且都與代謝、免疫和疾病相關，關乎嬰幼兒的成長發育。以系統性紅斑狼瘡為例，兒童系統性紅斑狼瘡的發病機制與多因素有關，包括遺傳、環境和免疫系統失調等，導致機體組織器官出現炎癥和損傷[29]。牛乳和驢乳中存在的吞噬通路、補體和凝血級聯反應通路，能夠調節免疫，起到一定的預防作用。

吞噬及補體和凝血級聯反應是驢常乳乳清蛋白主要參與的功能，乳清蛋白能夠增強巨噬細胞的吞噬能力，增強人體免疫功能[30]。補體系統和凝血系統相互關聯，維持體內平衡，補體C3為補體成分之一，能夠激活凝血功能[31]。從整體來看，驢常乳乳清蛋白參與的KEGG通路最為豐富，且參與內質網蛋白質加工、溶酶體、抗生素生物合成等，對于人體蛋白質的新陳代謝及免疫功能等方面具有重要價值。綜上可知，驢常乳相較于驢初乳、牛初乳和牛常乳更適合作為嬰幼兒功能性食品原料。

3 結 論

目前，通過傅里葉變換紅外光譜法對比乳清蛋白二級結構的研究較少。本研究通過對驢常乳、驢初乳、牛常乳和牛初乳乳清蛋白的結構和功能性質進行分析，對比它們的二級結構和功能差異性，為進一步利用不同泌乳期的牛乳與驢乳改良現有乳粉、開發更適用于嬰幼兒體質的新型配方乳粉提供了一定的數據參考。通過傅里葉變換紅外光譜對蛋白質二級結構進行分析可知，驢乳和牛乳乳清蛋白二級結構存在一定的差異，驢乳乳清蛋白中常見的二級結構相對含量高于牛乳，驢初乳與驢常乳乳清蛋白中α-螺旋結構相對含量相差不大，牛常乳中α-螺旋結構相對含量最低。與人乳中常見的二級結構進行對比，驢常乳整體與人乳最為接近。通過GO功能注釋和KEGG通路分析發現，驢乳和牛乳在生物學功能和參與的代謝通路方面也存在一定的差異。驢乳乳清蛋白參與的生物學功能和代謝通路的數量均高于牛乳，且驢常乳和牛常乳參與的KEGG通路種類數均多于初乳。整體而言，隨著泌乳期的延長，4 種乳中參與生物學功能和代謝通路的乳清蛋白種類數均增多，其中驢常乳乳清蛋白發揮的功能作用最明顯，更有益于嬰幼兒配方乳粉的改良。