復方荊芥顆粒的抗炎、鎮痛、祛痰作用以及急性毒性實驗研究

李 萍,安文藝,張譯方,畢小平*

(1山西醫科大學藥學院藥劑綜合實驗室,太原 030001;2山西省侯馬市安益生中醫研究院;*通訊作者,E-mail:bixping@163.com)

慢性咽炎為上呼吸道慢性炎癥的一部分,臨床表現以咽部干、癢、痛及灼熱、異物感較為多見[1,2]。其發病原因及可能的誘因有:病原微生物的感染,不健康的生活習慣,空氣質量下降等[3-5]。據統計,慢性咽炎的發病率占咽喉部疾病的10%-12%[6],發病率較高,且多呈現遷延難愈的特點。目前西醫治療慢性咽炎主要根據其感染的致病菌使用抗生素類藥物,因此會產生耐藥性及不良反應等問題。而中醫藥治療則具有療效確切、不良反應小、復發率低等優勢[7]。

復方荊芥顆粒的源處方是應用于臨床多年的經驗方,具有疏風清熱,利咽消腫,宣肺散結,祛風止痛,理氣健脾,燥濕化痰的功效,在慢性咽炎的治療方面療效確切。但湯劑諸多不便,本實驗室將其制備成顆粒劑,擬通過小鼠急性毒性實驗對該顆粒的安全性進行初步評價,進而依據該驗方的功能主治進行二甲苯致小鼠耳腫脹實驗、醋酸扭體實驗、氣管酚紅排泌實驗,研究該顆粒的抗炎、鎮痛、祛痰之功效,并初步探究該顆粒的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試藥

UV-1800PC紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);KQ-50DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XS205電子天平(梅特勒-托利多集團)。

復方荊芥顆粒(實驗室自制,批號20200908,20200909,20200910);復方金銀花顆粒(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司,批號20200129);生理鹽水注射液(石家莊四藥有限公司,批號2007242007);二甲苯(天津市風船化學試劑科技有限公司,批號20190103);酚紅(天津市風船化學試劑科技有限公司,批號20190908);醋酸(天津市天力化學試劑有限公司,批號20110228);維生素C(天津市大茂化學試劑廠，批號20160103)。

1.2 實驗動物

健康ICR小鼠,雄性,體質量(20±2)g;山西醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(晉)2015-0001。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥方式 取ICR小鼠40只,隨機分為高、中、低劑量組,陽性對照組和空白對照組,每組8只。根據《藥理實驗方法學》[8],以成人劑量的10倍、5倍、1倍給以復方荊芥顆粒水溶液,作為高、中、低劑量組,分別為0.8,0.4,0.08 g/d;陽性對照組給以復方金銀花顆粒,以0.8 g/d的劑量給藥;空白對照組給以同等體積的蒸餾水。給藥體積均為每10 g體質量灌胃給藥0.2 ml,24 h內給藥2次,連續給藥7 d,末次給藥前禁食不禁水。

1.3.2 耳腫脹實驗 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項下方法進行分組及給藥,給藥45 min后,取20 μl二甲苯均勻涂布于小鼠右耳正反兩面,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,用6 mm直徑打孔器將小鼠雙耳同部位切下,稱定各耳廓重量。并按以下公式計算腫脹率(%)和腫脹抑制率(%)[9],并以此評價復方荊芥顆粒的抗炎作用:腫脹率=[(右耳廓重-左耳廓重)/左耳廓重]×100%;腫脹抑制率=[(空白對照組腫脹率-給藥組腫脹率)/空白對照組腫脹率]×100%。

1.3.3 醋酸扭體實驗 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項下方法進行分組及給藥,給藥45 min后,腹腔注射0.6%醋酸溶液10 ml/kg,記錄注射后20-45 min內小鼠腹部內凹,伸展后肢,臀部抬高的次數,按照下式計算鎮痛百分率(%)[10],并以此評價顆粒的鎮痛作用：鎮痛百分率=[(空白對照組扭體次數-給藥組扭體次數)/空白對照組扭體次數]×100%。

1.3.4 氣管酚紅排泌實驗 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項下方法進行分組及給藥,給藥30 min后,腹腔注射1%酚紅溶液20 ml/kg,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,剪開其頸部皮膚,分離自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管,置于3 ml生理鹽水中,加入0.1 mol/L的NaOH溶液1 ml,超聲20 min顯色后,在546 nm處測定其吸光度值[11],以酚紅標準曲線y=0.379x+0.004(r=0.998 4),計算酚紅濃度及酚紅排泌量,按照下式計算祛痰百分率(%),并以此評價顆粒的祛痰作用：祛痰百分率=[(給藥組排泌量-空白對照組排泌量)/空白對照組排泌量]×100%。

1.4 小鼠急性毒性實驗方法

取20只ICR小鼠,隨機分為復方荊芥顆粒與空白對照組,每組10只。實驗前,禁食過夜,自由飲水。以最大劑量每10 g體質量給0.2 ml顆粒水溶液,24 h內給藥3次,合并作為1次劑量計算。記錄14 d內各組小鼠體質量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等。于觀察期滿后,頸椎脫臼處死小鼠并進行解剖,按照下式計算小鼠各臟器指數(%)[12]:臟器指數=各臟器濕重/小鼠體重×100%。

1.5 羥基自由基清除率的測定方法

1.5.1 溶液的配制 供試品溶液:稱取復方荊芥顆粒0.1 g,溶于10 ml蒸餾水中,濾過,稀釋10倍即得1 mg/ml的供試品溶液。

維生素C溶液:稱取維生素C約0.01 g,精密稱定,用蒸餾水溶解并定容至100 ml,得0.1 mg/ml維生素C溶液,臨用新制。

1.5.2 羥基自由基清除率的測定 取0.15 mmol/ml的亞甲藍溶液1 ml,于具塞刻度試管中,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液55 μl,加入供試品溶液或維生素C溶液50 μl,混勻后,加入10 mmol/L H2O2溶液55 μl,渦旋反應1 min,加入蒸餾水定容至10 ml,搖勻,于656 nm處測定吸光度值A1;以同體積蒸餾水代替樣品溶液,同法操作后,作為空白對照,于656 nm處測定吸光度值A2;以等濃度亞甲藍吸光度值為A0。根據以下公式計算自由基清除率S(%)[13]:S=(A1-A2)/(A0-A2)×100%。

1.6 統計學分析

2 實驗結果

2.1 耳腫脹實驗結果

由二甲苯致小鼠耳腫脹實驗可知,高、中、低劑量復方荊芥顆粒在炎癥抑制作用中存在明顯的劑量依賴關系,劑量越高,小鼠耳腫脹率越低,表明抗炎作用越強。與空白對照組比較,高、中劑量組小鼠耳廓腫脹率顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見表1)。且由腫脹抑制率可知,高、中劑量組與陽性對照組之間差異無統計學意義(見表1),表明高、中劑量對二甲苯導致的炎癥均有明顯的抑制作用。

表1 小鼠耳腫脹實驗結果

2.2 醋酸扭體實驗結果

由醋酸扭體實驗可知,高、中、低劑量復方荊芥顆粒在鎮痛作用中存在明顯的劑量依賴關系,劑量越高,扭體次數越少,表明鎮痛作用越強。與空白對照組比較,高、中劑量組小鼠扭體次數有顯著降低(P<0.01,見表2);且高劑量組與陽性對照組之間鎮痛百分率差異無統計學意義,表明復方荊芥顆粒對醋酸所致的疼痛有明顯的抑制作用。

表2 醋酸扭體實驗結果

2.3 氣管酚紅排泌實驗結果

由氣管酚紅排泌實驗可知,高、中、低劑量組在祛痰作用中存在明顯的劑量依賴關系,劑量越高,酚紅排泌量越高,表明祛痰作用越強。與空白對照組比較,高、中、低劑量組小鼠排泌量顯著增加(P<0.01,見表3),且高、中劑量組與陽性對照組之間祛痰百分率差異無統計學意義,表明復方荊芥顆粒具有祛痰作用。

表3 氣管酚紅排泌實驗結果

2.4 小鼠急性毒性實驗結果

觀察期內,復方荊芥顆粒組小鼠的外觀、飲食、行為活動、分泌物、排泄物等均正常,各組均未出現死亡情況,體質量增長率與空白對照組小鼠差異無統計學意義(P>0.05,見表4)。觀察期滿后,對小鼠進行大體解剖,并稱定心、肝、脾、肺、腎各組織的重量。結果表明,給藥組與空白對照組小鼠的各臟器指數均差異無統計學意義(P>0.05,見表5)。可初步判斷復方荊芥顆粒安全無毒。

表4 急性毒性實驗小鼠存活情況及體質量增長率

表5 急性毒性實驗小鼠各臟器指數

2.5 羥基自由基清除率測定結果

3批次自制復方荊芥顆粒的羥基自由基清除率測定結果顯示,0.5 mg顆粒的平均清除率為71.5%,與0.4 mg維生素C的抗氧化活性(72.2%)相當(見表6),表明顆粒具有較強的抗氧化活性。

表6 羥基自由基清除率測定結果

3 討論

本研究表明,復方荊芥顆粒具有抗炎、鎮痛作用,可能是與其抗氧化活性有關。復方荊芥顆粒中含有的主要活性物質包括揮發油、黃酮類化合物、多糖類化合物等。這些活性物質均具有抗氧化活性[14-16],也是抗炎、鎮痛的物質基礎。本顆粒劑可能是通過抗氧化作用,抑制活性氧激活促炎性轉錄因子的轉錄活性,從而抑制過量炎癥因子(如IL-6、TNF-α等)的產生[17,18],達到抗炎的目的。進而抑制因子TNF-α和IL-6導致的神經病理性疼痛[19]。當然,他們也可能是通過下調促炎因子的釋放,減輕炎性細胞浸潤,從而抑制炎癥反應[20-22];抑或是通過介導炎癥性疼痛氧化失衡而產生的痛行為來抑制疼痛[23,24],以及利用揮發油的中樞鎮痛活性來減輕小鼠的痛感[25]。故而,本文的研究結果為進一步深入探究復方荊芥顆粒抗炎、鎮痛作用的機制奠定了基礎。究竟該顆粒劑通過什么途徑發揮抗炎、鎮痛作用,以及祛痰作用機制如何,還有待于進一步深入研究。

綜上,復方荊芥顆粒安全無毒,具有抗炎、鎮痛、祛痰的作用,可為臨床治療慢性咽炎提供科學依據,具有一定的實際應用價值。