HPLC同時檢測參精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黃素成分的研究

楊 丹,姜 鴻,趙 玥,辛旭陽,趙 巖

(1遼寧中醫藥大學附屬第二醫院制劑室,沈陽 110034;2遼寧中醫藥大學附屬第二醫院藥學分析室;*通訊作者,E-mail:zzq2021@126.com)

參精止渴丸是由葛根、大黃、五味子、紅參、黃芪、黃精、茯苓、白術、黃連、甘草等10味藥材,經粉碎、過篩、混合、制丸、干燥等工藝制備而成的中藥成方制劑,其具有益氣養陰、生津止渴等功效,常用于治療氣陰兩虧、內熱津傷所致的消渴,病癥見少氣乏力、口干多飲、易饑、形體消瘦等,為II型糖尿病患者常用藥物[1]。據統計,2019年全世界約有4.63億糖尿病患者,預計到2045年患者將達到約7億人次,其中亞洲國家,尤其我國是糖尿病患者重災區,2019年度中國糖尿病患者約1.22億人次,居全球首位[2-4];隨著我國經濟社會的發展,人們生活水平的日益提高,預計2028年我國糖尿病患者數量將超過1.49億人,參精止渴丸作為臨床治療Ⅱ型糖尿病的有效藥物,收載于《中國藥典》2015年版一部,僅通過檢測葛根素含量作為含量控制指標[1],不能較好地指示該產品的質量水平,針對該產品中主要起功能作用的藥材葛根、五味子和大黃,控制好這3種藥材有效成分的含量,可以更好地控制該產品的療效,本文研究開發中藥制劑參精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黃素成分同時檢測的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

安捷倫1260 infinity型HPLC儀;幻芾聿Synergy型超純水儀;梅特勒AB204-S型電子天平;HB-8000型超聲波清洗器。

參精止渴丸(遼寧中醫學院藥業有限公司生產,規格:每100丸7 g,批號分別為:191212,200113,200421);葛根素對照品(批號:110752-201816,含量以95.4%計),五味子醇甲對照品(批號:110857-201815,含量以99.7%計),大黃素對照品(批號:110756-201913,含量以96.0%計),均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈:HPLC級(美國MERCK公司),磷酸等其他試劑:優級純(上海化學試劑廠),水為純水儀制備水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Waters X-bridge ODS C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速為1.0 ml/min,柱溫設定28 ℃,進樣體積為10 μl,檢測波長為252 nm,流動相A為乙腈,流動相B為0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫(見表1)。

表1 色譜洗脫程序

1.2.2 混合對照品溶液的制備 取葛根素、五味子醇甲和大黃素對照品,分別精密稱定76.3,299.1,76.8 mg,分別置100 ml容量瓶中,加95%甲醇溶解并稀釋至刻度,再分別取上述儲備溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇制成每1 ml溶液中分別含葛根素76.3 μg、五味子醇甲299.1 μg、大黃素76.8 μg的對照品混合儲備溶液;再分別精密量取上述對照品儲備溶液各1.0 ml,置10 ml容量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,即得。

1.2.3 供試品溶液 取參精止渴丸樣品,將內容物置研缽中研細,取約1.0 g,精密稱定,置50 ml容量瓶中,加95%甲醇35 ml,超聲提取25 min(超聲頻率80 kHz,功率200 W),放冷,加95%甲醇定容至刻度,搖勻,0.45 μm濾膜濾過,取續濾液,作為供試品溶液。

1.2.4 陰性供試品溶液 按參精止渴丸加工方法和藥材配比分別制備缺葛根、五味子和大黃素的陰性供試品,陰性供試品按2.3供試品溶液制備方法處理,分別制備陰性供試品溶液。

2 結果

2.1 系統適應性試驗

取1.2.2混合對照品溶液和1.2.3供試品溶液,按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。葛根素、五味子醇甲和大黃素均能達到基線分離,且各色譜峰之間分離度均大于1.5,以葛根素色譜峰計算理論塔板數大于5 000。結果表明色譜系統適應性良好。

2.2 專屬性試驗

分別取1.2.2混合對照品溶液、1.2.3供試品溶液和1.2.4陰性供試品溶液,按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。對照品溶液與供試品溶液中3種成分色譜峰保留時間一致,陰性供試品溶液無干擾(見圖1)。結果表明方法專屬性良好。

2.3 線性關系考察

取1.2.2混合對照品溶液,分別精密量取0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml,分別置10 ml量瓶中,加95%甲醇定容至刻度,搖勻,按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。分別以葛根素、五味子醇甲和大黃素峰面積為縱坐標(Y),對應的質量濃度為橫坐標(X)制作標準曲線,計算曲線方程和相關系數。結果見表2。

表2 線性范圍、回歸方程及相關系數

2.4 加樣回收試驗

取已知含量的參精止渴丸樣品(批號:191212),將內容物置研缽中研細,取約0.5 g,精密稱定,置50 ml容量瓶中,分別精密量取1.2.2項下葛根素、五味子醇甲和大黃素儲備溶液適量,加入到上述容量瓶中,后續按2.3供試品溶液方法處理,得樣品加標溶液,同法平行制備6份。按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。根據色譜圖中3種待測成分峰面積計算樣品中的加標量,與實際加入量計算加標回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.5 儀器精密度試驗

取1.2.2混合對照品溶液,按1.2.1色譜條件進樣10 μl,連續進樣6次,采集色譜圖。結果葛根素、五味子醇甲和大黃素精密度RSD分別為0.67%,1.01%和0.99%,結果表明儀器精密度良好。

1.葛根素;2.五味子醇甲;3.大黃素圖1 各溶液典型色譜圖Figure 1 Typical chromatogram of mixed reference solutions

2.6 方法重復性試驗

取同一批次參精止渴丸樣品(批號:191212),按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,同法平行制備6份供試品;再按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。結果葛根素、五味子醇甲和大黃素重復性RSD分別為1.17%,1.82%和1.53%,結果表明該方法重復性良好。

2.7 溶液穩定性試驗

取參精止渴丸樣品(批號:191212),按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,分別于室溫下放置0,1,3,6,9,12,24 h,按1.2.1色譜條件每個時間節點分別進樣10 μl,采集色譜圖。結果葛根素、五味子醇甲和大黃素峰面積RSD分別為1.37%,1.09%和0.79%,結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 市售樣品檢測

取參精止渴丸樣品(遼寧中醫學院藥業有限公司生產,規格:每100丸7 g,批號分別為:191212,200113,200421),分別按1.2.3供試品溶液方法處理,制備供試品溶液,再按1.2.1色譜條件分別進樣10 μl,采集色譜圖。根據色譜圖3種待測成分峰面積計算3份供試品中的含量。結果見表4。

表4 市售樣品含量測定結果 (mg/g)

3 討論

3.1 測定波長的優化

取葛根素對照品,精密稱取10 mg,加95%甲醇制備每1 ml溶液中含葛根素10 μg/ml的波長檢查溶液,同法制備五味子醇甲和大黃素波長檢查溶液。按1.2.1色譜條件,設定掃描波長在200-400 nm,分別進樣10 μl,采集色譜和光譜圖。結果,葛根素、五味子醇甲和大黃素分別在251,250,253 nm處有最大吸收,3種待測成分最大吸收波長均在252 nm附近。故實驗設定檢測波長為252 nm。

3.2 流動相的優化

參考《中國藥典》2015年版中,葛根中葛根素的測定流動相選擇甲醇 ∶水為25 ∶75,五味子中五味子醇甲的測定流動相選擇甲醇 ∶水為65 ∶35,大黃中大黃素的測定流動相選擇甲醇 ∶0.1%磷酸溶液為85 ∶15[5]。實驗分別選擇上述3種流動相體系,考察對葛根素、五味子醇甲和大黃素分離情況的影響。結果發現,選擇甲醇體系時,分析時間長,尤其是極性最弱的大黃素,出峰時間久、檢測效率低。選擇乙腈體系時,分析時間短,3種待測成分分離度較好,且效率更高。因此實驗選擇乙腈 ∶0.1%磷酸溶液作為流動相體系。

綜上所述,實驗為完善參精止渴丸質量標準,提高該產品的質量控制水平,建立了中藥制劑參精止渴丸中葛根素、五味子醇甲和大黃素成分同時檢測的HPLC方法。實驗結果表明,與藥典標準方法比較,本研究建立的方法增加了質量控制藥材品種,提高了產品的質量控制水平,此方法科學、簡單、檢測效率高,可以用于參精止渴丸產品的質量控制。