STAT6和PAX8在肺內孤立性纖維性腫瘤中的表達及臨床意義

陳詩軍,劉海濤,王效靜,2,慈紅非,李其才,李 偉*

(1蚌埠醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,蚌埠 233000;2呼吸系病基礎與臨床安徽省重點實驗室;3蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科;4蚌埠醫學院第一附屬醫院胸外科;*通訊作者,E-mail:bbmcliwei@126.com)

孤立性纖維性腫瘤(solitary fibrous tumors,SFTs)是一種罕見的成纖維細胞分化的間質腫瘤,一般認為起源于胸膜,目前無證據表明其發病與吸煙、石綿接觸等危險因素有明顯關系[1]。SFTs多見于臟、壁層胸膜、腹膜等間質組織[2,3],也偶發于肌肉、軟組織等結締組織[4],但原發于肺內的非常罕見[5]。目前關于肺內SFTs報道較少,并且診斷時容易與肺部其他軟組織腫瘤混淆,采用免疫組織化學法進行診斷及鑒別是必要的。目前,臨床常規采用CD34、CD99、Bcl-2、Ki-67免疫標記物進行標記,但其特異性和敏感性均不強,因此需要尋找更加理想的標志物來提高診斷及鑒別診斷。近年,有研究報道STAT6和PAX8在不同部位的SFTs中有不同程度的表達,有的甚至陽性表達極高,但對肺內SFTs中STAT6和PAX8標志物表達情況報道少見。因此,本實驗通過免疫組化檢測STAT6和PAX8在肺內SFTs及肺部其他軟組織腫瘤中的表達,比較其與常規檢測標志物CD34、CD99、Bcl-2對于該疾病診斷以及鑒別診斷的臨床價值,并結合臨床病例資料,探討其表達與臨床病理特征的關系,為肺內SFTs的診斷提供更準確的免疫標記物。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2012年8至2020年12月蚌埠醫學院第一附屬醫院診治的原發性肺內SFTs的患者臨床資料(包括性別、年齡、疾病史、治療方案、影像學、預后等)和組織標本。入組標準:①病理確診為孤立性纖維性腫瘤;②腫瘤位于肺內。排除標準:①既往有其他腫瘤病史;②手術后復發病例;③院外未進行放化療。符合兩項標準的患者共19例。其中,男性10例,女性9例,男女比例1.0 ∶0.9,年齡17-77歲,中位年齡61歲。同時另外選取14例肺內常見的軟組織腫瘤(神經鞘瘤3例,神經纖維瘤2例,炎癥性肌纖維母細胞瘤8例,平滑肌肉瘤1例)作為對照組。本研究獲得蚌埠醫學院倫理委員會的批準并對患者知情同意書的豁免(批號:2020139)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 STAT6兔單克隆抗體(稀釋比例1 ∶250),PAX-8兔單克隆抗體,CD34鼠單克隆抗體,Bcl-2兔單克隆抗體,CD99鼠單克隆抗體,Ki-67鼠單克隆抗體,STAT6和PAX-8染色需用pH9.0的EDTA修復液,試劑及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學檢測 所有病例標本采用ElivisionTMplus法按照說明書進行免疫組織化學染色。10%的中性福爾馬林固定標本,常規脫水、石蠟包埋,切片厚3 μm,HE染色,顯微鏡下觀察。STAT6兔單克隆抗體為稀釋比例1 ∶250,STAT6和PAX-8染色需用pH9.0的EDTA修復液進行水煮加熱抗原修復,按照說明書進行操作。按照實驗要求常規設置陰性及陽性對照。

1.2.3 免疫組織化學結果判定 采用獨立雙盲法,所有切片的免疫組化染色結果由兩位經驗豐富的的病理醫師進行判讀。CD34、CD99、Bcl-2表達定位于胞質或胞膜,STAT6和PAX-8定位于胞核,Ki-67定位于胞核。選擇染色陽性的細胞區域,鏡下至少觀察10個具有代表性的高倍鏡視野(HPF,放大400倍),然后按照染色陽性細胞的染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。根據染色強度評分:無明顯著色,1分;淡黃色,2分;棕黃色,3分;棕褐色,4分。根據陽性細胞所占百分比評分:陰性,0分;陽性細胞<11%,1分;10%<陽性細胞<51%,2分;50%<陽性細胞<76%,3分;陽性細胞>75%,4分。細胞染色強度評分乘以陽性細胞占比評分為最終得分,范圍為0-12分。分數>2分被認為是陽性結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS23.0軟件對數據進行分析,抗體在肺內SFTs組及對照組腫瘤中的表達情況采用Fisher確切概率法進行比較;STAT6和PAX-8的表達與各臨床病理參數之間的關系亦采用Fisher確切概率法進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床和影像學特征

19例患者中,9例(47.37%)為女性,10例(52.63%)為男性,平均年齡56.95歲,60歲及以上12例(63.16%);14例患者以胸悶、氣喘、咳嗽等為主要臨床表現,5例無任何臨床癥狀;腫瘤直徑≥10 cm以上8例(42.11%)。肺內SFTs最常見于左肺,11例(57.89%),尤其是左下肺。胸部CT平掃示:左下肺可見巨大不規則團塊狀軟組織密度影,密度均勻,邊界尚清楚(見圖1A);胸部增強CT示:邊界尚清楚,內部輕度不均勻強化,可見血管影,呈“地圖樣”分布,平均CT值約45 Hu(見圖1B)。14例行手術治療,所有腫瘤全部切除,術后1例患者出現包裹性液氣胸并發癥,術后CT復查無復發或轉移,現生存狀態良好,5例行保守治療(其中3例死亡,2例失訪)(見表1)。

A.CT平掃顯示巨大軟組織腫塊影,密度均勻B.增強CT提示腫瘤內部不均勻強化圖1 左下肺孤立性纖維性腫瘤強化前后的CT圖像Figure 1 CT features of isolated fibrous tumor of left lower lung before and after enhancement

表1 19例原發肺內孤立性纖維性腫瘤患者的臨床病理特征、治療及預后情況

2.2 STAT6和PAX8在肺內SFTs及對照組腫瘤中的表達水平

根據免疫組織化學結果顯示,19例肺內SFTs中,STAT6和PAX8的陽性率分別為94.74%(18/19)和31.58%(6/19),而在對照組腫瘤中STAT6僅2例陽性表達(均為炎癥性肌纖維母細胞瘤),陽性率為14.29%(2/14),PAX8僅1例陽性表達(炎癥性肌纖維母細胞瘤),陽性率為7.14%(1/14);STAT6和PAX8在兩組腫瘤中均定位于細胞核(見圖2,表2),但僅STAT6在兩組中表達具有明顯差異,差異有統計學意義(P<0.001)。同時,CD34在兩組腫瘤中表達也具有明顯差異(P<0.001)。CD34、CD99、Bcl-2、Ki-67表達定位于胞質或胞膜(見圖2);5種標志物的敏感度和特異度表達如下:STAT6分別為94.74%和85.71%;PAX-8分別為31.58%和92.86%;CD34分別為78.95%和85.71%;CD99分別為68.42%和35.71%;Bcl-2分別為84.21%和21.43%。其中,STAT6和CD34在兩組腫瘤中敏感度和特異度均較高,但PAX-8特異度最高(見表2)。

圖2 肺內孤立性纖維性腫瘤中免疫組織化學檢測 (ElivisionTM plus法,×400)Figure 2 Immunohistochemical staining of primary intrapulmonary solitary fibrous tumors (ElivisionTM plus,×400)

表2 肺內SFTs和對照組腫瘤中抗體的表達情況

2.3 肺內SFTs中STAT6和PAX8表達與臨床病理參數的關系

根據免疫組化結果提示,STAT6和PAX8在原發肺內SFTs的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑大小、細胞增殖指數(Ki-67)、細胞核核分裂象等臨床特征之間無明顯差異(P>0.05,見表3)。

表3 肺內SFTs中STAT6和PAX8免疫組織化學表達與臨床病理參數關系 (例)

3 討論

1931年Klemperer等[6]首次報道胸膜孤立性纖維性腫瘤,其是一種罕見的表達CD34抗原的樹突狀纖維母細胞瘤,認為其起源于間皮下。然而,隨著免疫組化和超微結構研究,人們逐漸認為SFTs起源于結締組織中的原始成纖維細胞樣細胞,腫瘤細胞為間葉細胞[7]。SFTs最常見于胸膜,SFT極少出現在肺、腎臟、中樞系統等部位,原發于肺內的SFTs占肺間葉性腫瘤的比例不到0.2%。

肺內SFTs患者通常于臨床偶然發現,可能與胸痛、咳嗽有關。有研究報道[8],肺內SFTs發病年齡7-81歲,最常見于左肺,臨床多無明顯癥狀,可表現為咳嗽、胸悶、胸痛、胸腔滲出等。我們報告的19例患者中,發病年齡為17-77歲,左下肺最常見,以中老年為主,男女比例1.0 ∶0.9,5例患者為臨床偶然發現,14例患者表現為胸悶、氣喘、咳嗽,其余有腰痛、發熱、腹部隱痛等少見臨床表現,與既往的相關報道具有相似性[8]。值得注意的是,我們其中1例患者出現難治性反復發生的低血糖,因其無法手術最終導致死亡。目前這種情況考慮由肺內SFTs繼發的非胰島素細胞瘤低血糖癥,稱之為Doege-Potter syndrome(DPS),低血糖(出汗、震顫、焦慮和意識喪失)是其主要癥狀,可作為診斷SFTs的初始指標,其機制可能為IGF-Ⅱ與胰島素亞型A和IGF-1R結合,導致低血糖,同時也促進腫瘤有絲分裂和惡性轉化,表明伴有低血糖的SFTs更有惡性傾向,對于鑒別良惡性有重要意義,但本例患者Ki-67及增殖指數均未達到惡性診斷標準,原因有待進一步研究[9]。

肺內SFTs在胸部X線和CT掃描上顯示卵圓形或圓形肺結節及腫塊影,但它們是非特異性的表現。有學者認為[10],肺內SFTs的腫塊CT增強后大多數可以呈現地圖樣改變,動脈期細胞密集區可見迂曲匍行的血管影,細胞稀疏區強化較弱,壞死區無強化,各種區域同時存在形成“地圖樣”分布的外觀,認為是其特征性表現。而本組收集的19病例中15例強化后也呈現上述“地圖樣”影像學表現,其間可有散在血管影通過,其他病例表現可有不明顯強化、強化不均等,因此這種影像學表現對診斷肺內SFTs具有指導意義。然而,在增強CT上,增強類型有相當大的重疊,100%的惡性和60%的良性胸膜SFT表現出異質性增強,說明單憑CT征象很難區分[11]。

由于肺內SFTs的臨床特點和影像學表現不明確、組織學上的多樣性,使得與肺內其他軟組織腫瘤相互鑒別具有一定難度,因此免疫組織化學標記檢查對確診肺內SFTs的診斷尤為重要。

傳統上認為,SFTs中常見標志物陽性表達多見于CD34,存在于高達95%的病例中,然而在其他相似的SFTs,如軟組織會陰瘤、隆突皮膚纖維肉瘤和梭形細胞脂肪瘤中也存在表達,并且有5%-10%的明顯組織學特征的SFTs中CD34甚至可以不表達[12]。此外,CD99和Bcl-2在SFTs中的陽性率可超過70%[13],甚至有研究顯示[14],Bcl-2陽性見于幾乎所有的SFTs,但這種標志物是非特異性的,因為在各種其他間充質腫瘤中也觀察到其表達。本研究顯示,在19例肺內SFTs中,CD34的陽性率為78.95%(15/19)、CD99的陽性率為68.42%(13/19)、Bcl-2的陽性率為84.21%(16/19),并且其特異性:CD34為85.71%、CD99為35.71%、Bcl-2為21.43%,與以往的研究具有一致性。因此,常見的SFTs免疫組化標志CD34、CD99、Bcl-2對于疾病的診斷及鑒別診斷其敏感性和特異性不是十分理想。

STAT6是胞質轉錄因子STAT家族的一員,通過將信號傳遞到細胞核并結合特定的DNA啟動子序列來調控基因表達,對細胞分化、生長和凋亡的調控等正常細胞過程至關重要。與STAT6相比,NAB2與轉錄因子EGR家族的相互作用而發揮轉錄抑制因子的作用,并定位于細胞核[15]。然而,NAB2在與STAT6融合時獲得激活結構域,NAB2-STAT6融合基因充當轉錄激活因子,誘導EGR靶基因的表達,從而導致增殖增加,與正常組織和其他腫瘤相比,融合蛋白可導致細胞核易位和高水平的表達[16]。2013年在SFTs中發現關鍵的NAB2-STAT6基因融合,染色體12q13.3內存在倒置,導致NAB2(NGFI-A結合蛋白2)和STAT6基因在90%以上的病例中存在基因融合體,從而促進了隨后的免疫組織化學檢測核STAT6的表達,其作為SFTs的一種新的輔助診斷手段,具有極高的敏感性和特異性[17,18]。一項中樞神經系統間充質腫瘤的研究中,Schweizer等[19]在腦膜SFTs和血管周細胞瘤中發現了NAB2-STAT6融合基因,證實了腦膜“血管周細胞瘤”確實是SFTs的一種超細胞變異,并通過免疫組化的方法檢測發現,核STAT6蛋白的表達與NAB2-STAT6基因檢測具有高度的一致性[20]。因此,檢測STAT6蛋白表達能反映融合基因信息,其對于診斷SFTs及鑒別其他軟組織腫瘤具有明顯的優勢。Demicco等[21]大范圍檢測間充質腫瘤中STAT6表達情況時發現,STAT6核強陽性表達在2 021例腫瘤中表達285例,其中240例SFT中206例,同時也發現在未分化/分化脂肉瘤(49/408)、未分類肉瘤(8/65)、纖維瘤病(14/184)中核/質陽性表達,STAT6完全缺失最常見于多形性脂肪肉瘤(60%)和肺泡軟組織肉瘤(72%)。本研究使用單克隆抗體STAT6,在19例肺內SFTs中,STAT6陽性表達于細胞核,其陽性率為94.74%(13/14);STAT6標志物的敏感度和特異度表達分別為94.74%和85.71%。STAT6在對照組肺部平滑肌肉瘤、神經鞘瘤、神經纖維瘤均不表達,然而在肺部炎癥性肌纖維母細胞瘤中有陽性表達(3/8),提示確診肺內SFTs時需要與此鑒別。最新的WHO腫瘤分類指南對SFTs進行一些調整[22],SFTs的ICD-O編碼由既往為0改為1,即良性腫瘤定義為潛在惡性,惡性的SFTs的ICD-O編碼為3。Diebold等[23]對SFTs的多變量分析中指出,增殖指數(Ki-67)≥10%、核分裂象≥4/10HPF、腫瘤>10 cm與不良結局獨立相關,并且多見于惡性。本研究結果提示,患者性別、年齡、腫瘤部位及直徑大小、細胞增殖指數(Ki-67)、細胞核核分裂象等臨床參數與肺內SFTs中STAT6的表達情況無關,因此肺內SFTs細胞增殖指數、核分裂象、腫瘤直徑等對于腫瘤良惡性的區分仍具有一定的局限性,并非絕對關系。那么對于STAT6表達情況與患者預后之間的關系仍需要進一步研究。

PAX8是由9個基因組成的家族成員之一,基因編碼參與調節轉錄配對盒DNA結合結構域,對胚胎發生過程中器官形成以及維持某些器官功能至關重要,尤其是腎臟、甲狀腺[24]。事實上,PAX8常見于腎臟、甲狀腺濾泡和上皮性婦科腫瘤中,此外,甲狀旁腺、胸腺和某些神經內分泌腫瘤,特別是胰腺、闌尾和直腸起源的腫瘤,可以表達PAX8,而在肺、乳腺等腫瘤中幾乎不表達,因此PAX8對于鑒別肺部腫瘤具有重要的意義[24,25]。Ullman等[26]研究顯示,在30例SFTs中PAX8和STAT6陽性率分別為43%(13/30)和93%(28/30),其中PAX8中有8例彌漫性陽性表達,5例局部陽性表達,并且胸膜外SFTs比胸膜SFTs更容易表達PAX8(77%vs18%,P=0.001);對照組肉瘤樣腎細胞癌或梭形細胞腫瘤中PAX8陽性率可達50%-87%,而STAT6均為陰性表達。與此同時,有學者研究了41例SFTs中PAX8陽性率(26.8%,11/41)與臨床病理參數的關系,結果提示其陽性率與患者性別、年齡、腫瘤直徑、分布位置、惡性與否及轉移復發均無明顯關系[27]。本研究結果顯示,在19例肺內SFTs中,PAX8陽性率為31.58%(6/19),細胞信號位于細胞核,而14例對照組腫瘤中僅1例出現PAX8陽性信號表達,顯示出現92.86%(13/14)特異性,特異性明顯高于其余4種標志物。并且,肺內SFTs中PAX8的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤細胞增殖指數(Ki-67)、腫瘤細胞核核分裂象等臨床特征之間無明顯相關性。由此可見,PAX8對于鑒別肺內SFTs具有重要作用,但同時也可能對SFTs的診斷過程中容易造成誤判,診斷前最好排除轉移性肉瘤樣癌或者梭形細胞樣的其他腫瘤。

綜上所述,鑒別診斷肺內SFTs需要臨床表現、影像學、免疫組織化學等聯合判斷,而免疫標志物檢測至關重要。其中,STAT6和PAX8聯合檢測在肺內SFTs的診斷及鑒別診斷具有重要作用,相較傳統標志物具有更高的敏感性和特異性。