鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究

李 媛，耿藝娟，于浩飛，孫夢(mèng)楨，張?zhí)m春，張榮平，胡煒彥*

1昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500

隨著國內(nèi)外老齡化進(jìn)程的加速，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病率正日益增高，成為繼阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease，AD)的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。帕金森病患者人均經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)占人均年收入的57.0%，占家庭年收入24.2%，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。2018年6月，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、科技部、工信部、藥監(jiān)總局、中醫(yī)藥管理局5部門聯(lián)合公布的《第一批罕見病目錄》中，帕金森病被收錄其中。帕金森病病因及病理機(jī)制復(fù)雜，目前的研究認(rèn)為帕金森的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、環(huán)境、免疫等多因素有關(guān)[3]，但尚未完全明晰。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，破壞核酸和蛋白質(zhì)，損傷核糖核酸(RNA)和核脫氧核糖核酸(DNA)，尤其對(duì)線粒體DNA造成損傷[4]。線粒體功能障礙和能量代謝異常被認(rèn)為是神經(jīng)元損傷的主要驅(qū)動(dòng)因素[5]。盡管PD的分子機(jī)制尚未完全闡明，但眾多證據(jù)表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)死亡和神經(jīng)功能障礙，是PD重要的病理機(jī)制之一[6]。保護(hù)神經(jīng)元氧化損傷對(duì)PD的預(yù)防和治療至關(guān)重要，優(yōu)質(zhì)抗氧化劑是PD潛在的治療藥物[7]。

鼠尾草酸是唇形科植物迷迭香(RosmarinusofficinalisL.，英文名：Rosemary)的主要成分，是一種高效天然抗氧化劑，具有抗氧化、延緩衰老作用，能夠抑制Aβ聚集，保護(hù)Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷[8,9]。但是，鼠尾草酸是否具有保護(hù)MPTP導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，進(jìn)而用于PD的防治藥物的研發(fā)候選藥物尚缺乏深入的研究。因此，本研究體外培養(yǎng)多巴胺神經(jīng)元，用MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，探究鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕14 天 C57BL/6(C57)孕鼠，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滇)-2011004。

1.2 試劑與儀器

鼠尾草酸(Sigma-Aldrich(Shanghai)Trading Co.Ltd，貨號(hào)：3650-09-7)；木犀草素(Sigma-Aldrich (Shanghai)Trading Co.Ltd，貨號(hào)：L9283)；B-27加神經(jīng)元培養(yǎng)基(B-27 plus neurobasal medium)；伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶(trypsine)等均購自Thermo Fisher 公司；磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自Invitrogen公司；MPTP、多聚賴氨酸(poly-l-lesine，PLL)購自Sigma公司；TH抗體、綠色熒光二抗購自Abcam公司。

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等購自碧云天生物技術(shù)有限公司；核糖核酸(RNA)提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；GAPDH及caspase 3基因引物均有Invitrogen公司(上海)合成。GAPDH，上游引物：F：TGACGTGCCGCCTGGAGAAA，下游引物 R：AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG；caspase 3，上游引物 F：ACCGATGTCGAT GCAGCTAA，下游引物 R：GGTGCGGTAGAGT AAGCATA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胎鼠多巴胺神經(jīng)元分離和培養(yǎng)

無菌操作下取出孕14天胎鼠的中腦腹側(cè)組織，剪碎，置0.125% Trypsine 中，37 ℃水浴消化15 min，用含10%FBS 的DMEM終止消化，吹打下細(xì)胞，75 μm篩網(wǎng)過濾，濾液1 000 rpm，離心5 min。沉淀中加入B-27 plus neurobasal medium混懸，再次離心(1 000 rpm，5 min)，沉淀中加入B-27 plus neurobasal medium混懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0 ×105個(gè)/mL，接種于PLL包被過的96孔板(120 μL/孔)，6孔板(2 mL/孔)和放有玻片的24孔板(0.5 mL/孔)中。37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后半換液，72 h后加入阿糖胞苷(2.5 mg/L)，120 h后更換為B-27 plus neurobasal medium，繼續(xù)培養(yǎng)。分別用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 神經(jīng)元活力檢測(cè)

神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，參考文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將設(shè)定劑量的鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)加入96孔板處理30 min后，加入MPTP(10.0 μmol/L)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，加入20 μmol/L的木犀草素(luteolin，Lut)作為陽性對(duì)照，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照，加入鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)但不加MPTP處理做藥物對(duì)照。24 h后，加入CCK-8(20 μL/孔)溶液，設(shè)定加入相應(yīng)體積培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有細(xì)胞的孔作為試劑空白對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。在450 nm測(cè)定吸光度。

各組細(xì)胞活力=[(各組吸光度-試劑空白對(duì)照組吸光度)/

(溶劑空白組吸光度 -試劑空白對(duì)照組吸光度)]× 100%

1.3.3 神經(jīng)元形態(tài)觀察

神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，將設(shè)定劑量的鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)加入24孔板處理30 min后，加入MPTP(10.0 μmol/L)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，加入木犀草素(20 μmol/L)作為陽性對(duì)照，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照。24 h后，吸出培養(yǎng)液，預(yù)熱的PBS洗三次后加入4% PFA固定，取出玻片，用含1% Triton 的封閉液封閉1 h后，加一抗(TH)4 ℃孵育12 h，DPBS洗3 次(5 min/次)，加入偶聯(lián)的熒光二抗室溫孵育60 min，PBS洗3次(5 min/次)，裝片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.4 神經(jīng)元總RNA 提取

神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，將設(shè)定劑量的鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)加入24孔板處理30 min后，加入MPTP(10 μmol/L)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，加入木犀草素(20 μmol/L)作為陽性對(duì)照，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照。24 h后，加入Trizol裂解液，按RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA。

1.3.5 RT-PCR反應(yīng)

按照RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下：逆轉(zhuǎn)錄體系包括標(biāo)本總RNA 500 ng，逆轉(zhuǎn)錄酶1.25 μL，寡核苷酸1.25 μL，核苷酸引物5 μL，緩沖液5 μL，不含RNase的水補(bǔ)齊至25 μL。37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min，cDNA 4 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括cDNA 1 μL，上游引物0.20 μL，下游引物0.20 μL，緩沖液5 μL，PCR參比染料0.20 μL，不含RNase的水2.80 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.3.6 SOD活性和MDA含量檢測(cè)

神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，將設(shè)定劑量的鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)加入24孔板處理30 min后，加入MPTP(10 μmol/L)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，加入木犀草素(20 μmol/L)作為陽性對(duì)照，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照。24 h后，去除培養(yǎng)液，置冰上，按SOD活力測(cè)定試劑盒和MDA含量測(cè)定試劑盒操作說明書操作測(cè)定各組SOD活力和MDA含量。

1.3.7 培養(yǎng)液中LDH漏出量的檢測(cè)

神經(jīng)元培養(yǎng)第7天，將設(shè)定劑量的鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)加入24孔板處理30 min后，加入MPTP(10 μmol/L)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，加入木犀草素(20 μmol/L)作為陽性對(duì)照，加入相同體積DMSO作溶劑空白對(duì)照。24 h后，收集培養(yǎng)上清液，按LDH定量測(cè)定試劑盒說明書操作檢測(cè)各組培養(yǎng)液中LDH的漏出量。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元活力降低的影響

神經(jīng)元活力檢測(cè)結(jié)果顯示，MPTP(10 μmol/L)作用24 h后，神經(jīng)元活力顯著降低；而不同劑量鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)預(yù)處理30 min均可改善由MPTP導(dǎo)致的神經(jīng)元活力降低，與MPTP組比較，高、中劑量組(鼠尾草酸20、80 μmol/L處理組)具有顯著性差異，但低劑量組(鼠尾草酸5 μmol/L處理組)，差異無顯著性(見表1)。

表1 鼠尾草酸對(duì)神經(jīng)元活力的影響

2.2 鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元形態(tài)的影響

共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，與正常組相比，MPTP(10 μmol/L)作用24 h后，神經(jīng)元萎縮，軸突斷裂，樹突減少。而中、高劑量鼠尾草酸(20、80 μmol/L)預(yù)處理30 min可改善這一現(xiàn)象，神經(jīng)元軸突斷裂減少，樹突增多(見圖1)。

圖1 鼠尾草酸對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的影響Fig.1 The effect of carnosic acid on neuronal morphology注：A：模型組；B：空白對(duì)照組；C：陽性對(duì)照組；D：鼠尾草酸低劑量組；E：鼠尾草酸中劑量組；F：鼠尾草酸高劑量組，下同。Note：A:model group;B:Control group;C:Luteolin group;D:CA-L group;E:CA-M group;F:CA-H group,the same below.

2.3 鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MPTP(10 μmol/L)作用24 h后，caspase-3 mRNA和總caspase-3及剪切型caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高；而不同劑量鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)預(yù)處理30 min可逆轉(zhuǎn)caspase-3 mRNA(見表2)和總caspase-3及剪切型caspase-3蛋白表達(dá)的異常升高(見圖2)。

表2 鼠尾草酸對(duì)caspase-3 mRNA 表達(dá)的影響

圖2 鼠尾草酸阻止MPTP誘導(dǎo)的caspase 3活性異常升高(n=4)Fig.2 Carnosic acid prevents MPTP-induced abnormal increase in caspase-3 activity (n=4)注：總caspase-3 的量歸一化到β-actin；剪切型caspase-3的量歸一化到總caspase-3；與空白對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。Note:The amount of total caspase-3 is normalized to β-actin;the amount of cleaved caspase-3 is normalized to total caspase-3;##P<0.01 vs the reagent blank control group;**P<0.01, *P<0.05 vs MPTP group.

2.4 鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元SOD活性和MDA含量的影響

超氧化物歧化酶(SOD)可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)自由基代謝,減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，保證免遭自由基損傷，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的。PD患者體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除失去平衡，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，過氧化脂質(zhì)以及氧自由基代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)生成增多，引起細(xì)胞毒性。為了探究鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元是否具有抗氧化作用，我們檢測(cè)了多巴胺神經(jīng)元SOD活性和MDA含量。結(jié)果顯示，MPTP(10 μmol/L)作用24 h后，神經(jīng)元SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加；預(yù)先給予鼠尾草酸(20、80 μmol/L)預(yù)處理30 min，可明顯逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，與MPTP組比較，中、高劑量鼠尾草酸處理組神經(jīng)元SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低(見表3)。

表3 鼠尾草酸對(duì)神經(jīng)元MDA含量和SOD活性的影響

2.5 鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元培養(yǎng)液中LDH漏出的影響

乳酸脫氫酶是生物體內(nèi)糖酵解途徑中一種至關(guān)重要的氧化還原酶，其可催化乳酸氧化為丙酮，在機(jī)體自身免疫調(diào)節(jié)與炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為了探究鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元培養(yǎng)液中LDH漏出是否有影響，我們檢測(cè)了多巴胺神經(jīng)元培養(yǎng)液中LDH水平。結(jié)果顯示，MPTP(10 μmol/L)作用24 h后，培養(yǎng)液中LDH漏出量顯著增加；預(yù)先給予鼠尾草酸(5、20、80 μmol/L)預(yù)處理30 min，可明顯降低培養(yǎng)液中LDH漏出，與MPTP組比較有顯著性差異(見表4)。

表4 鼠尾草酸對(duì)神經(jīng)元LDH漏出的影響

3 討論與結(jié)論

帕金森的臨床治療藥物有多巴胺受體激動(dòng)劑、單胺氧化酶B(MAO-B)抑制劑、抗膽堿能藥物、復(fù)方左旋多巴制劑、金剛烷胺以及神經(jīng)保護(hù)劑等[10-12]。盡管用于治療帕金森的藥物種類很多，但仍然沒有能徹底根治帕金森的藥物。腦內(nèi)過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致核酸崩解和脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)，引起線粒體功能障礙，進(jìn)而可神經(jīng)元丟失。線粒體功能障礙促進(jìn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)、衰老以及神經(jīng)退行性改變，直接參與PD等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程[13]，高質(zhì)量的抗氧化劑可能是潛在的治療藥物[14]。

鼠尾草酸是迷迭香的多酚類主要成分之一，具有良好的抗氧化作用，長期被用作食品、日化產(chǎn)品抗氧化[15]，已有研究顯示鼠尾草酸及以鼠尾草酸為主要成分的迷迭香提取物具有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[16,17]，但其能否保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元氧化損傷，開發(fā)成用于預(yù)防治療PD的藥物，尚未研究證實(shí)。1 -甲基- 4 -苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-pheyl-1,2,3,6-tetra-hydrophridine，MPTP)是一種神經(jīng)毒劑，在體內(nèi)代謝產(chǎn)生1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)，MPP+進(jìn)入線粒體后抑制氧化呼吸鏈復(fù)合體I的活性，引起多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物產(chǎn)生類似帕金森病的癥狀，是一種公認(rèn)的構(gòu)建PD模型的金標(biāo)準(zhǔn)[18-20]。在本研究中，我們用MPTP(10 μmol/L)處理體外培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)MPTP處理后，神經(jīng)元萎縮，軸突斷裂，樹突減少，神經(jīng)元活力降低，神經(jīng)元caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，MDA含量和培養(yǎng)液中LDH漏出顯著增加，神經(jīng)元SOD活性明顯降低。而用鼠尾草酸預(yù)處理后，可逆轉(zhuǎn)MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元形態(tài)萎縮和活力降低；同時(shí)可逆轉(zhuǎn)MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)元caspase-3 mRNA和蛋白的異常升高；降低MDA的含量和LDH的漏出；增強(qiáng)神經(jīng)元SOD的活性。表明鼠尾草酸對(duì)MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，由于鼠尾草酸可降低MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元MDA的含量和LDH的漏出，增強(qiáng)神經(jīng)元SOD的活性，我們推測(cè)鼠尾草酸對(duì)帕金森的保護(hù)作用可能與抗氧化損傷有關(guān)。木犀草素(luteolin)是一種天然，存在于多種植物中具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、祛痰、降尿酸、抗過敏和免疫增強(qiáng)等作用。研究報(bào)道，木犀草素和蘆丁組合物，能夠減輕 6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，抑制PD模型大鼠的震顫行為，減輕 DA 能神經(jīng)元損傷和炎性因子的生成、釋放；可以改善MPTP誘導(dǎo)帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平、抑制炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)元損傷[21]。因此本實(shí)驗(yàn)選用木犀草素作為陽性對(duì)照藥。

本研究結(jié)果顯示鼠尾草酸對(duì)MPTP導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化，神經(jīng)元氧化損傷和逆轉(zhuǎn)caspase-3異常激活有關(guān)，但尚需更為嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)(例如設(shè)計(jì)在MPTP損傷多巴胺神經(jīng)元后用不同劑量CA用來改善MPTP帶來的神經(jīng)損傷，加入拮抗劑，線粒體其他相關(guān)蛋白檢測(cè)等實(shí)驗(yàn))。本研究可為迷迭香的深入開發(fā)利用提供幫助，同時(shí)也為PD預(yù)防治療藥物的研發(fā)提供參考。