運用數據挖掘和網絡藥理學探討糖尿病認知功能障礙中醫用藥規律和作用機制

石崯力，王 旭，盛 沛，張 擎，梁 婕

南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 210029

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遺傳和環境多重因素造成胰島素分泌或生物作用缺陷，臨床以慢性高血糖為特征的一組代謝性疾病。流行病學調查發現近三分之一DM患者合并不同程度的認知功能障礙[1]，多表現出健忘、學習及記憶能力減退、認知缺失等癥狀，嚴重者病情可進展至不可逆性癡呆。中醫將糖尿病認知功能障礙(diabetic cognitive dysfunction，DCD)歸于“消渴”“呆病”范疇，認為該病多由年邁腎虛、情志所傷、飲食失調、久病耗損等內外病因綜合影響所致[2]。近年來運用中藥治療DCD的研究逐漸增加，積累大量臨床數據，將其規范、總結是現代醫學研究的大方向。通過對治療DCD的中醫處方進行探尋,挖掘潛在配伍藥物組合并提煉用藥規律，為今后臨床選方用藥提供借鑒。本研究基于對文獻數據庫進行檢索,通過數據挖掘技術進行關聯、聚類和因子分析，研究其用藥規律，并通過網絡藥理學對核心組方治療DCD的有效活性成分和潛在靶點進行初步預測，篩選出相關生物學功能相關通路，對核心組方治療DCD的復雜作用機制進行初步探究，為科研和臨床提供新思路和可靠依據。

1 資料與方法

1.1 文獻來源與檢索策略

以(主題=糖尿病認知功能障礙or主題=糖尿病認知障礙or主題=糖尿病腦病)and(關鍵詞=中醫or關鍵詞=中醫藥)匹配，檢索中國知網(CNKI)、萬方數據(WF)、維普期刊全文數據庫(VIP)、生物醫學文獻數據庫(CBM)、及中國科學引文數據庫(CSCD)自1999年1月至2020年10月收載的文獻。

1.1.1 納入標準

采用以下納入標準對文獻進行篩選：(1)治療DCD的公開發表的中醫臨床研究文獻，包括證治探討、名家經驗和臨床觀察等，DCD的診斷應符合國內外公認的標準[3,4]；(2)研究對象未合并其他病癥；(3)文獻所報道的中藥復方、中成藥資料完整；(4)中藥在對照實驗研究中具有顯著明確的臨床療效；(5)作者使用同一觀點重復發表的文獻只取一篇。

1.1.2 排除標準

采用以下排除標準對已納入的文獻進行進一步篩選：(1)綜述類、動物實驗、源于會議、科普類文獻；(2)采用針灸、推拿、食療、護理等非中醫處方治療或中西醫結合治療DCD的文獻；(3)非糖尿病所引起的認知功能障礙的文獻。

1.2 中藥材數據的規范化

參照全國高等中醫藥院?！笆濉币巹澖滩摹吨兴帉W》[5]將表達相同的中藥進行歸類處理，并將中藥別名或俗稱予以規范。如將“丹皮”“牡丹皮”統一為“牡丹皮”，“生地”“生地黃”統一為“生地黃”，“法半夏”“半夏”統一為“半夏”等。

1.3 數據處理和分析

根據標準排除篩選后將納入的文獻內中藥處方及中藥材逐一輸入至Microsoft Excel 2019，進行排序、校對和整理，建立中藥治療DCD數據庫。運用IBM SPSS Modeler 18.0、SPSS Statistics 25.0軟件對高頻中藥進行因子、聚類分析以及關聯規則網絡圖的制作。

1.4 通過網絡藥理學進行作用機制分析

1.4.1 核心組方化合物的篩選和預測

運用TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索核心組方化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug like，DL)≥0.18為閾值條件[6]進行初步篩選，納入中藥有效活性成分，建立中藥化學成分數據集。通過SuperPred數據庫(http://prediction.charite.de/)對篩選出的化合物進行相關靶點預測[7]，利用UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)，將種屬設置為“homo sapiens”，對去重后的有效靶點信息進行規范化。

1.4.2 DCD疾病靶點的預測

以“diabetic cognitive dysfunction”“diabetic encephalopathy”等為關鍵詞，通過OMIM(http://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Genecards(https://www.genecards.org/)、PharmGkb(http://www.pharmgkb.org/)和Drugbank數據庫(http://www.drugbank.ca/)獲取DCD潛在疾病靶點并建立疾病信息數據集[8]。

1.4.3 核心組方藥物-有效成分-靶點-疾病網絡的構建

將篩選出的有效化合物、其潛在的靶點蛋白和疾病的導入至Cytoscape 3.8.0軟件(http://www.cytoscape.org/)構建“核心組方藥物-有效成分-靶點-疾病”共有機制網絡，并使用Network Analyzer功能對核心組方中的有效成分進行分析。

1.4.4 蛋白質—蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

利用Stitch和String數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)分別構建核心組方潛在靶點與疾病靶點的PPI網絡，選擇種屬為“homo sapiens”，篩選條件為“minimum required interaction score>0.7”，將得到的蛋白質互作關系導入Cytoscape 3.8.0軟件構建成分靶點和疾病靶點相互作用 PPI網絡[9]，并通過CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，以網絡拓撲參數點度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)和接近中心性(closeness centrality，CC)均大于中位數為標準，篩選發揮藥效的主要活性成分以及核心靶點[10]。

1.4.5 關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析

將核心靶點導入DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)[11]，將“gene list”及“background”設置為“homo sapiens”。運用R Studio軟件下載“ggplot2”擴展包[12]，設定閾值P< 0.01，FDR < 0.01，進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析；下載“dplyr”和“org.Hs.eg.db”安裝包，以閾值P< 0.01、FDR < 0.01進行關鍵基因基因本體(GO)功能分析，最終以條形圖和氣泡圖的形式輸出結果。

1.4.6 分子對接驗證

通過分子對接技術對核心組方內的關鍵成分和關鍵靶點之間的互作關系進行進一步的探究。研究表明[13]，二甲雙胍(metformin)作為經典的降糖藥物，能一定程度改善糖尿病患者認知障礙，因此以其作為陽性對照藥物。具體步驟為：通過Pubchem網站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索獲取關鍵成分的3D結構，下載SDF文件并利用Open Babel 2.3.2軟件將SDF文件轉化為PDB文件，從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數據庫中檢索關鍵靶點的受體蛋白，利用AutoDockTools軟件對受體蛋白進行去水、去配體、加氫、平衡電荷等修飾，用Grid程序下的Grid Box命令打開Grid Option工具對每個受體蛋白進行處理，利用AutoDock Vina 1.1.2對受體蛋白與配體小分子分別進行分子對接。分子對接的結果以一種結合能(affinity)的形式輸出，是衡量配體是否能與受體分子有效結合的重要指標，一般認為對接得分小于-4.25 kcal/mol可認為配體與靶點之間具有結合活性，得分小于-5.0 kcal/mol則認為結合活性較佳，得分小于-7.0 kcal/mol則認為兩者之間有強烈的對接活性。

2 數據挖掘結果

2.1 治療DCD的中藥使用頻次統計

根據標準排除篩選，共納入符合的文獻33篇，涉及中藥加減處方共123首，中藥共137味，總使用頻數為1 381次，使用中藥頻次最高的前十位依次是：當歸、熟地黃、甘草、川芎、茯苓、枸杞子、桃仁、黃芪、石菖蒲和白芍，并對中藥在中藥組方中出現的頻率進行統計。使用頻數大于25次的中藥共20味(見表1)。

表1 治療糖尿病認知功能障礙的處方頻數大于25次的中藥材統計

續表1

2.2 治療DCD的中藥關聯分析

通過 SPSS Modeler 18.0軟件應用apriori算法對使用頻數大于25次的20味高頻中藥進行建模，以查找各中藥間的相關性與因果關系。設置關聯參數：最小支持度大于20%,最小置信度大于80%，支持度提示藥對或藥物組合同時出現的頻率，置信度則提示當藥物組合前項出現時，后項藥物出現的概率。結果得到桃仁-紅花、川芎-紅花、當歸-桃仁-川芎、川芎-紅花-桃仁、熟地黃-菟絲子-枸杞子等核心藥物組合共26組(見表2)。

表2 糖尿病認知功能障礙處方高頻中藥關聯分析

2.3 治療DCD的中藥聚類分析

使用SPSS Statistics 25.0統計軟件對使用頻數大于25次的20味高頻中藥進行聚類分析。采用組間連接的系統聚類算法，運算后可得到6類，即為DCD的核心配伍藥物組合用于臨證加減(見圖1)。分別是：(1)桃仁、紅花、當歸、川芎；(2)枸杞子、菟絲子、熟地黃；(3)甘草、白芍、丹參；(4)石菖蒲、遠志、黃芪；(5)半夏、白術、茯苓；(6)山藥、山茱萸、五味子、麥冬。

圖1 糖尿病認知功能障礙處方中藥聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of diabetes cognitive dysfunction prescription注：右側中藥材由上至下的順序為：桃仁、紅花、川芎、當歸、枸杞子、菟絲子、熟地黃、甘草、白芍、丹參、石菖蒲、遠志、黃芪、半夏、白術、茯苓、山藥、山茱萸、五味子、麥冬。以下圖中數字對應的中藥材與圖1相一致。Note:The order of Chinese herbal medicines from top to bottom is:Persicae Semen;Carthami Flos;Chuanxiong Rhizoma;Angelicae Sinensis Radix;Lycii Fructus;Cuscutae Semen;Rehmanniae Radix Praeparata;Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Paeoniae Radix Alba;Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma;Acori Tataninowii Rhizoma;Polygalae Radix;Astragali Radix;Pinelliae Rhizoma;Atractylodis Macrocephalae Rhizoma;Poria;Dioscoreae Rhizoma;Corni Fructus;Schisandrae Chinensis Fructus;Ophiopogonis Radix.The Chinese herbal medicines corresponding to the numbers in the figures below are the same as those in figure 1.

2.4 治療DCD的中藥因子分析

為了探尋高頻中藥間潛在的結構關系，運用SPSS Statistics 25.0統計軟件對高頻中藥進行因子分析，通過KMO檢驗和Bartlet球形檢驗比較變量間相關系數的差異，結果顯示抽樣適合性檢驗KMO=0.600，Bartlet球形檢驗P=0.000，差異具有顯著性P<0.05，認為變量間存在較強的依賴性，符合因子分析標準。采用主成分分析法，設置提取初始特征值大于1，可提取公因子數為8個，累計貢獻率為78.53%。設置最小載荷量為0.5，得出桃仁(0.896)、紅花(0.861)、川芎(0.841)、當歸(0.645)在成分F1上載荷量較高；在成分F2上載荷量前四位為熟地黃(0.755)、枸杞子(0.801)、菟絲子(0.842)、半夏(0.513)；五味子(0.701)和麥冬(0.869)在成分F3上載荷量較高；在成分F4上載荷量較高的中藥為山藥(0.843)、山茱萸(0.876)；在成分F5上載荷量較高的中藥為石菖蒲(0.856)、遠志(0.540)和白芍(0.682)；在成分F6上載荷量最高的前三位分別是甘草(0.808)、茯苓(0.565)和白術(0.576)；在成分F7-8上載荷最高分別為黃芪(0.815)和丹參(0.904)，由此將各成分上載荷量較高的中藥提煉為公因子(見表3)。通過kaiser標準化的全體旋轉法得到旋轉因子載荷圖(見圖2)。

表3 公因子信息表

圖2 糖尿病認知功能障礙中藥處方旋轉因子載荷圖Fig.2 Rotational load diagram for prescription factor analysis of diabetic cognitive dysfunction

3 網絡藥理學結果

3.1 核心組方化學成分篩選

根據關聯、聚類和因子分析，綜合得到“當歸、桃仁、紅花、川芎、熟地黃、枸杞子、菟絲子、石菖蒲、白芍”9味中藥組成的核心組方。從TCMSP數據庫中根據OB、DL值篩選核心組方的潛在活性化學成分共109個(見表4)。

表4 核心組方中109個候選化合物的基本信息

續表4(Continued Tab.4)

續表4(Continued Tab.4)

3.2 DCD疾病靶點篩選

通過OMIM、TTD、PharmGkb和Drugbank數據庫分別收集DCD相關靶點基因590、282、44、61個，通過Genecards數據庫獲得“diabetic cognitive dysfunction”為關鍵詞的靶點5 236個、“diabetic encephalopathy”為關鍵詞的靶點2 556個，將二者靶點合并后去重；relevance score代表靶點與疾病的密切程度，根據其由高到低排序，取前1 000個作為DCD的潛在靶點；經去重后共收集到1 490個DCD疾病相關靶點。

3.3 “核心組方藥物-有效成分-靶點-疾病”共有網絡的構建

將上述的經剔除無對應靶點的核心組方有效化學成分、重復靶點和疾病的相關靶點導入至Cytoscape 3.8.0軟件，構建“核心組方藥物-有效成分-靶點-疾病”網絡圖，其包含了349個節點和1 723條關系(見圖3)。網絡中節點的大小與度值呈正比關系，其中度值(degree)排在前三位的化合物為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。

圖3 “核心組方藥物-有效成分-靶點-疾病”共有網絡圖Fig.3 Common network of "core prescription drugs-active ingredients-targets-disease"注：藍色表示疾病靶點；紅色表示核心組方中藥物名稱；綠色表示核心組方有效成分；棕色表示共有化合物成分。Note:The blue section represents the disease target;The red portion represents the core prescription drug;The green portion represents the active ingredient;The brown portion represents a common compound ingredient.

3.4 PPI網絡的構建與分析

利用Stitch和String數據庫分別獲得核心組方和疾病潛在靶點PPI網絡；通過Cytoscape 3.8.0軟件進行合并，去除19個單獨的靶點GABRA2、GABRA5、PLAT、PSMD3、NR3C2、ECE1、GABRA1、G6PD、THBD、CHRNA7、MGAM、DPP4、SCN5A、ADRA2A、ACHE、NR1I3、PTGS1、RXRA、PPP3CA后獲得核心組方治療DCD相關潛在作用靶點76個。運用Cytoscape軟件中CytoNCA插件通過對中心網絡進行拓撲分析，篩選最終得到24個核心靶點(見圖4)，其中degree值排名前3位的靶點依次為：TP53、IL6、FOS，由此推測其是作為核心藥物治療DCD中發揮重要作用的關鍵靶點，將用于后續的分子對接驗證。

3.5 關鍵靶點的代謝通路與生物過程分析

3.5.1 藥物-疾病核心靶點GO分析

將獲得的核心組方治療DCD交互的潛在靶點利用DAVID數據庫進行GO分析，結果可獲得237條GO富集功能，其中生物過程(biological process，BP)相關的條目最多，共183條，23條細胞組成(cellular component，CC)和31條分子生物學功能(molecular function，MF)。以P<0.01，FDR<0.01為篩選條件選取GO條目，其涉及調控糖脂代謝、細胞凋亡、炎癥反應、蛋白質磷酸化、蛋白酶結合、血管生成等生物學過程。運用R Studio軟件下的“dplyr”“org.Hs.eg.db”和“ggplot2”擴展包對上述的分析結果前20條進行可視化處理(見圖5)。

圖4 核心組方治療DCD靶點的PPI網絡Fig.4 The core prescription drugs PPI network for the treatment of DCD targets

圖5 核心組方治療DCD潛在核心靶點的GO功能分析(前20位)Fig.5 GO function analysis of core prescription drugs for treating DCD potential core targets (Top 20)

3.5.2 藥物-疾病KEGG通路富集分析

利用DAVID數據庫對核心組方治療DCD交互的核心靶點進行KEGG通路分析，共獲得96條富集通路，以P<0.01，FDR<0.01為篩選條件選取共66條KEGG條目。分析結果提示核心靶點與TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路、鞘脂信號通路、VEGF信號通路和胰島素信號通路等有關，與此同時還發現核心靶點與多種癌癥、病毒感染性疾病、寄生蟲病等存在聯系。運用R Studio軟件對篩選后的前30條KEGG通路結果進行可視化處理(見圖5)。

圖6 核心組方治療DCD潛在核心靶點的KEGG富集功能分析(前30位)Fig.6 KEGG enrichment function analysis of core prescription drugs for treating DCD potential core targets (Top 30)

3.6 分子對接驗證

通過對核心組方中主要活性成分進行分子對接驗證，結果顯示，配體小分子均穩定地位于對接口袋內(見表5)。與二甲雙胍相比，核心組方的主要活性成分與關鍵靶點之間對接更為緊密，其中與TP53和FOS結合能最低的活性成分為槲皮素，與IL6結合能最低的活性成分為β-谷甾醇。運用PyMOL作三維圖展示槲皮素與配體小分子FOS(PDB ID:1fos)之間的相互作用(見圖7)。

表5 核心組方有效成分和二甲雙胍與TP53、FOS、IL6分子對接結果

圖7 FOS與槲皮素的分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking diagram of FOS and quercetin

4 討論與結論

DCD是糖尿病常見的慢性并發癥之一，對患者的疾病預后、生活質量造成不良的影響。中醫對DCD無專門病名，多將其歸于“消渴”“呆病”“癡呆”范疇，現多認為其發病病機為本虛標實，病位在腦，涉及脾、腎等多臟腑。脾失健運，不能游溢精微，積于中焦使其運化機能受損，意舍不清,影響心神[14]；病程日久，或因痰蒙神竅，或因瘀血阻絡，或因痰瘀毒互結，集聚腦絡，腦失所養，導致DCD的發生發展，患者多表現出健忘、精神恍惚、認知減退。病程日久，痰濕、瘀血、濁毒等病理產物相互作用耗損陰陽，終致腎精不足，髓海空虛[15,16]。

前針對DCD尚無明確完善的西醫治療方案，而中醫藥在治療DCD方面優勢突出，在降低血糖血脂、延緩記憶減退、減輕毒副作用、提高生活質量等方面均取得良好的臨床療效。本研究基于對中醫臨床處方進行數據挖掘分析，通過頻次統計發現DCD用藥多為川芎、桃仁、丹參、紅花、當歸、黃芪、熟地黃等具有活血化瘀、補氣補血之味和半夏、石菖蒲、遠志等理氣化濕、醒神益智之品。活血化瘀與補虛藥物性味多甘、溫，配伍使用可化腦絡瘀阻，調氣血通暢，補正氣虛損。肝為瘀血生成之樞，善用肝經藥物引經報使，行氣活血，通利化瘀。理氣開竅藥與安神藥甘苦同用，肺脾同治，氣行則濕化，氣順則痰消，則化濁開竅，醒腦通絡。關聯分析結果提示桃仁-紅花、川芎-紅花、當歸-紅花、枸杞子-菟絲子具有高頻率和強相關性。聚類分析和因子分析發現，公因子F1、F8(包括桃仁、紅花、川芎、當歸、丹參)以活血化瘀通絡為主，是為“逐瘀湯”的基礎，并歸氣血，養活同施，既可除病因通腦絡，又可匡扶正氣，主治瘀血所致之證；公因子F2、F4(包括熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、菟絲子等)以補虛為主，其中熟地黃、山藥、山茱萸三陰并補，補腎益精，養肝健脾，為“地黃丸”重要組成部分，主治肝腎虧損之證；公因子F2、F3、F5、F6、F7(包括半夏、茯苓、白術、甘草、石菖蒲等)以理氣化濕醒腦為主，其中半夏和茯苓相結合，為“二陳湯”的基礎，取燥濕散結與利水滲濕之效，主治痰濁所致之證。聚類分析與因子分析結果相似，客觀地證明治療DCD中藥配伍有規可循。

根據數據挖掘分析結果得出，當歸、桃仁、紅花、川芎、熟地黃、枸杞子、菟絲子、石菖蒲、白芍9味藥組成的核心組方能從多角度、多維度、多層面反映中醫藥從“活血化瘀、補腎填髓、開竅醒腦”基本法則治療DCD。從微觀角度，核心組方中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇等化合物發揮了重要的作用。槲皮素不僅能降低胰島素抵抗和空腹血糖水平，而且可調節海馬區SIRT1活性蛋白和NLRP3炎癥小體表達，不僅可以緩解內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而且還可抑制海馬區異常炎癥反應，保護神經元異常退變[17]。山奈酚是一種天然類黃酮化合物，不僅能通過抑制NO降解實現對細胞的抗氧化保護，還可通過調節MAPK、PI3K-Akt通路降低炎癥因子表達，抑制內質網過度應激[18]。β-谷甾醇[19]可通過激活胰島素下游信號分子以降低IRS-1磷酸化，上調IR-1和AKT蛋白的表達，抑制PKCq和NF-κB通路傳導，削弱海馬區炎癥反應。PPI網絡及拓撲分析表明，核心組方通過TP53、FOS、IL6、MAPK14、CASP3、ERS1、IL1B等核心靶點治療DCD的可能性較大，涉及糖脂代謝、血管生成、炎癥反應、細胞老化和凋亡等生物學過程。

通過FOS、IL6、IL1B、MAPK14、CASP3等基因可誘導下游轉錄因子，激活TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣通路、FoxO信號通路發揮作用，使得炎性因子磷酸化以調控細胞炎癥反應[20]。這些信號通路不僅與細胞凋亡、炎癥反應之間關系緊密，也與ERS和細胞自噬相關。當機體能量供給不足引起內質網平衡紊亂，通過MAPK信號通路、FoxO信號通路多重調節細胞自噬，清除細胞質中的異常蛋白，調控自噬通量，抑制ERS，減少淀粉樣蛋白在海馬區的異常沉積以保護神經元[21,22]。雌激素信號通路介導多種雌激素核受體抑制海馬神經元內部的ERS，維持內質網穩定，阻斷Caspase級聯反應，調控CASP3基因以保護細胞存活，對認知功能障礙產生一定程度的良性調節[23]。Toll樣受體(TLRs)被證明可通過胰島素信號通路和Toll樣通路激活胰島素下游信號分子，上調胰島β細胞周圍蛋白的活性，調控全身胰島素敏感性和血脂分布[24]。

通過數據挖掘發現目前中醫組方治療DCD多從行氣活血化瘀、化痰醒腦開竅、滋陰填精固腎的大方向入手，從中挖掘出當歸-桃仁-川芎、當歸-紅花-川芎、川芎-紅花-桃仁、熟地黃-菟絲子-枸杞子等核心藥物配伍，為日后臨床應用提供寶貴治療經驗和參考；基于網絡藥理學對中醫治療DCD遣方用藥中的核心組方潛在作用機制進行初步分析，由此對中醫醫家治療疾病過程中所用的藥物給出科學的解釋。同時，本研究還存在一定的不足和缺陷，包括納入中醫臨床處方數量有限、文獻質量參差不齊等，數據挖掘和網絡藥理學尚停留于理論層面，對核心藥物有效成分作用DCD的具體作用機制還需進一步的基礎實驗加以驗證。