天麻素聯合異鉤藤堿通過線粒體途徑抑制MPP+誘導PC12細胞凋亡

李曉明，榮 華，潘思文，董妙先

齊齊哈爾醫學院 醫藥科學研究所，齊齊哈爾 161006

帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是一種伴隨運動缺陷癥狀的中樞神經系統退行性疾病。90%以上的PD為散在性發作，約10%的PD為家族性遺傳發作。PD主要病理生化特征是黑質多巴胺能神經元漸進性缺失，導致紋狀體多巴胺水平降低[1]，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropridine，MPTP)具有線粒體復合物Ⅰ抑制作用，進入體內后生成活性1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)，MPP+在線粒體內產生的自由基引起線粒體損傷[2]。線粒體介導的多巴胺能神經元凋亡是PD重要病理機制[3]。在PD患者死亡后的腦組織中，一些瀕死的神經元表現出凋亡的形態學特征[4]。針對線粒體損傷而開展的PD治療研究受到基礎和臨床醫學研究者的廣泛關注。自1967年Cotzias等將左旋多巴首次成功應用于PD臨床治療以來，多巴胺替代治療一直是治療PD的主要手段，但這種療法僅能在一定程度上緩解臨床癥狀，不能從根本上延緩疾病進程[5]。中醫藥治療PD具有療效穩定持久，毒副作用較小的優勢。隨著對PD發生、發展凋亡機制的研究深入，中藥有效成分聯合在PD神經保護治療中展現出顯著優勢[6]。我們前期研究發現，天麻素和異鉤藤堿均在體內體外帕金森病模型中發揮神經保護作用[7，8]，PD是遺傳和環境因素引起的復雜疾病，基于多靶點的聯合用藥治療PD越來越受到關注。本研究旨在探討天麻素和異鉤藤堿聯合應用保護MPP+誘導PC12細胞凋亡的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Safire 2型酶標儀(瑞士Tecan公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)；Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀(Agilent公司)；JY-ZY5電泳槽和JY200C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；Smart ChemiTMImage Analysis System(北京賽智創業科技有限公司)；HL-2000分子雜交箱(美國UVP公司)；ELX800全自動酶標儀(BioTek公司)。

1.1.2 細胞株和藥品

PC12細胞株(中科院上海細胞庫)；MPP+iodide(Sigma-Aldrich公司，批號：035M4782V)；異鉤藤堿(南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ18102901)；天麻素(南京景竹生物科技有限公司，批號：JZ18061402)；氯化鋰(Lithium chloride,LiCl；Sigma-Aldrich公司，批號：MKBV0497V)；LY294002(Sigma-Aldrich公司，批號：092M4616V)；PD98059(Sigma-Aldrich公司，批號：MKBR5598V)。

1.1.3 試劑和引物

Caspase-Glo?3/7Assay(Promega公司，批號：0000126888)；Quantikine?rat/mouse cytochromecassay kit(R&D systems公司，批號：P131219)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(挧圣生物，批號：J6901150)；高靈敏度化學發光檢測試劑盒(康為世紀公司，批號：022819190619)；二抗(康為世紀公司，批號：40420)；Anti-Akt antibody(Santa Cruz公司，批號D0219)；Anti-p-Akt antibody(Santa Cruz公司，批號：J0721)；Cell Titer 96?AQueous Non-Radioactive cell Proliferation Assay(Promega公司，批號：0000312867)；Cell Death Detection ELISAPLUSAssay Kit(Roche公司，批號：29876600)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)/NADH Quantification Kit(BioVision公司，批號：9G020337)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理

PC12細胞用含10%小牛血清及1%青霉素- 鏈霉素混合液的DMEM培養液培養，細胞置于37 ℃、5%CO2的培養箱中，每2～3天更換1次培養液。細胞密度生長融合達70%～80%時傳代。加入250 μM MPP+預處理對數生長期的PC12細胞1 h后，加入天麻素(1 μM)和/或異鉤藤堿(0.3 μM)共同孵育24 h后，收集細胞。為了分析細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)和糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信號通路的作用，在MPP+損傷之前，PC12細胞用PD98059、LY294002或/和氯化鋰預處理30 min。

1.2.2 caspase-3/7活性檢測

按Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒說明書，PC12細胞加入Caspase-Glo?試劑，在室溫孵育60 min后，酶標儀測量熒光值。通過計算處理組熒光值/對照組熒光值來確定caspase-3/7的活性。

1.2.3 JC-1染色法檢測線粒體膜電位

按JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書，PC12細胞加入JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min，JC-1染色緩沖液洗滌，細胞培養液重懸PC12細胞，采用流式細胞儀檢測JC-1線粒體膜電位。

1.2.4 細胞色素C(cytochromec，Cyt-c)含量檢測

按Quantikine?rat/mouse cytochromecassay kit試劑盒說明書，收集PC12細胞上清液，加Cyt-c結合物，加洗液，加底物溶液，加停止液。在450 nm處酶標儀測定光密度。用標準物濃度和OD值繪制標準曲線，計算PC12細胞培養上清中Cyt-c含量。

1.2.5 免疫印跡檢測Akt磷酸化水平

采用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取PC12細胞蛋白質，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，濕法轉膜，TBST封閉液(含5%脫脂牛奶)室溫封閉PVDF膜2 h。加入p-Akt一抗雜交液4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加相應二抗37 ℃孵育2 h。加入超敏化學發光液發光，X光片曝光。圖像分析軟件AlphaEaseFCTM(瑞士Alpha Innotech公司)分析印跡條帶的積分光密度，并用Akt1積分光密度值進行歸一化。

1.2.6 細胞增殖分析

按CellTiter 96?AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒說明書測定細胞增殖活性，酶標儀490 nm處測定吸光度值，細胞存活率=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.7 細胞凋亡檢測

按Cell Death Detection ELISAPLUSAssay Kit試劑盒說明書，裂解PC12細胞，離心取上清液。加入檢測試劑孵育，加入終止液，405 nm處測定OD值。

1.2.8 分光光度法測定細胞總NAD和NADH含量

按照NAD+/NADH Quantification Kit說明書用操作，酶標儀450 nm處測定吸光度值，根據標準曲線計算總NAD和NADH含量。

1.2.9 統計學分析

2 結果

2.1 天麻素、異鉤藤堿單用及聯用對PC12細胞凋亡和caspase-3/7活性的影響

ELISA結果顯示(如圖1A),與空白對照組比較，MPP+組PC12細胞凋亡顯著增加(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素組和異鉤藤堿組PC12細胞凋亡顯著減少(均P<0.05)。與天麻素或異鉤藤堿單獨處理組比較，天麻素聯合異鉤藤堿組細胞凋亡顯著減少(均P<0.05)。如圖1B所示，與空白對照組比較，MPP+組caspase-3/7活性顯著增加(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素組和異鉤藤堿組caspase-3/7活性顯著減少(均P<0.05)。而天麻素聯合異鉤藤堿組caspase-3/7活性較二者單獨處理組顯著降低(均P<0.05)。天麻素聯合異鉤藤堿對PC12細胞凋亡和caspase-3/7活性的抑制效應可部分被PD98059和LY294002或LiCl單獨預處理逆轉，而PD98059、LY294002和LiCl聯合預處理則完全逆轉這些藥理效應。

圖1 天麻素聯用異鉤藤堿對MPP+處理的PC12細胞凋亡(A)和caspase-3/7活性(B)的影響Fig.1 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on apoptosis (A) and caspase-3/7 activity (B) in MPP+-treated PC12 cells注：與空白對照組比較，*P<0.05；與MPP+組比較，§P<0.05；與天麻素或異鉤藤堿單用組比較，§P<0.05；GAS：天麻素；IRN：異鉤藤堿，下同。Note:*P<0.05 vs control;§P<0.05 vs MPP+;§P<0.05 vs GAS or IRN alone;GAS:Gastrodin;IRN:Isorhynchophylline.

2.2 天麻素聯用異鉤藤堿對MPP+誘導的PC12細胞增殖的影響

MTS分析結果顯示(見圖2)：與空白對照組比較，MPP+組細胞增殖活性顯著減少(P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素聯合異鉤藤堿組細胞增殖活性顯著增加(均P<0.05)，且天麻素聯合異鉤藤堿對細胞增殖活性的提高作用可部分被PD98059或LY294002單獨預處理逆轉，DPI則完全逆轉天麻素聯合異鉤藤堿對細胞增殖活性的提高作用。

圖2 天麻素聯合異鉤藤堿對MPP+處理的PC12細胞增殖的影響Fig.2 Effects of gastrodin combined with isorhynchophylline on cells proliferation in MPP+-treated PC12 cells

2.3 天麻素、異鉤藤堿單用及聯用對MPP+處理PC12細胞線粒體跨膜電位和Cyt-c釋放的影響

如圖3所示，與空白對照組比較，MPP+組PC12細胞JC-1紅/綠比值顯著降低(P<0.05)，而細胞培養上清液中cyct-C含量顯著增加(P<0.05)。與MPP+組比較，天麻素組JC-1紅/綠比值顯著增加(P<0.05)，而細胞培養上清液中cyct-C含量顯著減少(P<0.05)。異鉤藤堿組JC-1紅/綠比值顯著增加(P<0.05)，而細胞培養上清液中cyct-C含量無顯著性差異(P>0.05)。天麻素聯合異鉤藤堿對JC-1紅/綠比值的增加效應和對細胞培養上清液中cyct-C含量的降低效應明顯強于二者單獨處理組(均P<0.05)。天麻素聯合異鉤藤堿對JC-1紅/綠比值的增加效應和對細胞培養上清液中cyct-C含量的降低效應可部分被PD98059、LY294002或LiCl單獨預處理逆轉，而PD98059、LY294002和LiCl聯合預處理則完全逆轉這些藥理效應。

圖3 天麻素、異鉤藤堿單用及聯用對JC-1紅/綠比值(A)和細胞培養上清液中cyct-C含量(B)的影響Fig.3 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on JC-1 aggregates/JC-1 monomers ratio (A) and supernatant cytochrome c concentration (B) in MPP+-treated PC12 cells

2.4 天麻素聯合異鉤藤堿對NAD+含量和NAD+/NADH比值的影響

如圖4A和B所示，與空白對照組比較，MPP+組NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著降低(均P<0.05)；與MPP+組比較，天麻素聯合異鉤藤堿組NAD+含量和NAD+/NADH比值顯著增加。天麻素聯合異鉤藤堿對NAD+含量和NAD+/NADH比值的增加效應可部分被PD98059、LY294002或LiCl單獨預處理逆轉，而PD98059、LY294002和LiCl聯合預處理則完全逆轉天麻素聯合異鉤藤堿對NAD+含量和NAD+/NADH比值的增加效應。

圖4 天麻素聯合異鉤藤堿對MPP+處理的PC12細胞NAD+含量(A)和NAD+/NADH比值(B)的影響Fig.4 Effects of gastrodin combined with isorhynchophylline on NAD+ concentration (A) and NAD+/NADH ratio(B) in MPP+-treated PC12 cells

2.5 天麻素、異鉤藤堿單用及聯用對MPP+處理PC12細胞Akt磷酸化水平的影響

我們以前研究發現，天麻素增加了MPP+處理的SH-SY5Y細胞ERK1/2磷酸化水平[8]，異鉤藤堿減少了GSK-3β磷酸化水平[7]，Akt是調控GSK-3β磷酸化的關鍵上游信號分子[9]。因此，我們進一步觀察天麻素、異鉤藤堿單用及聯用對MPP+處理PC12細胞Akt磷酸化水平的影響。Western blot結果顯示(如圖5A和B)：與空白對照組比較，MPP+組Akt磷酸化水平無顯著性差異(P>0.05)；與MPP+組比較，天麻素單獨組Akt磷酸化水平無顯著性差異(P>0.05)，異鉤藤堿單獨組和天麻素聯合異鉤藤堿組PC12細胞Akt磷酸化水平均顯著增加(均P<0.05)。而天麻素聯合異鉤藤堿組PC12細胞Akt磷酸化水平與異鉤藤堿單獨組之間無顯著性差異(P>0.05)。表明天麻素聯合異鉤藤堿活化Akt的藥物組分是異鉤藤堿，而不是天麻素。

圖5 天麻素或/和異鉤藤堿對MPP+處理的PC12細胞Akt磷酸化的影響Fig.5 Effects of gastrodin and/or isorhynchophylline on Akt phosphorylation in MPP+-treated PC12 cells

3 討論與結論

以改善運動癥狀為核心的多巴胺替代治療目前仍是PD治療的基石，但受到遠期療效和并發癥的制約[10]。 “神經保護”已成為延緩PD進展的重要治療策略[11]。PD是由多種因素導致的發病機制復雜疾病，而聯合用藥誘導的生物靶標之間的協同作用可能是改善PD復雜病理的有效手段。中藥復方天麻鉤藤飲能明顯改善PD患者癥狀，我們在前期研究中發現，天麻素和異鉤藤堿分別是天麻和鉤藤的抗PD的主要活性成分[9]。

在PD患者腦中已經檢測到許多凋亡的神經元和氧化應激，而氧化應激是啟動細胞凋亡信號通路的重要因素[12]，而多巴胺能神經元過度凋亡在PD的進展中都起關鍵作用，PD的各種病因最終可經細胞凋亡這一共同通路導致PD發病[13]。MPTP通過腦血屏障被膠質細胞攝取氧化后生成MPP+，中腦多巴胺能神經元通過多巴胺轉運體攝取MPP+后，在線粒體內抑制線粒體復合物I活性，導致中腦黑質多巴胺能神經元凋亡，MPTP/MPP+是誘導PD模型的有效藥物[14]。本研究顯示，MPP+增加PC12細胞凋亡和caspase-3/7活性，天麻素或者異鉤藤堿單獨均能顯著抑制PC12細胞凋亡和caspase-3/7活性，天麻素和異鉤藤堿聯用的抑制作用明顯強于二者單獨抑制作用。

近年來隨著對線粒體結構和功能的深入研究，發現PD的進行性發展與線粒體密切相關[15]。線粒體功能障礙導致線粒體外膜通透性增加，線粒體內Cyt-c釋放到細胞質，并與凋亡蛋白酶激活因子1結合形成多聚體，激活caspase-9和caspase-3，導致靜息狀態的核酸內切酶活化，最終引起DNA斷裂和細胞凋亡[16]，而多巴胺能神經元凋亡可導致PD的發生。本研究顯示，MPP+降低PC12細胞JC-1紅/綠比值，增加細胞培養上清液cyct-C含量，而天麻素和異鉤藤堿聯合應用對JC-1紅/綠比值的增加和細胞培養上清液cyct-C降低的效應明顯強于二者單獨應用，提示天麻素和異鉤藤堿聯合應用的神經保護作用與改善線粒體功能障礙有關。ERK1/2、Akt和GSK-3β信號通路在天麻素和異鉤藤堿聯合應用神經保護作用中發揮重要作用。

煙酸進入體內后可以在酶的作用下生成NAD+和NADP+。NAD+是呼吸鏈的重要組成之一，參與生物體內的氧化還原反應，提高細胞內NAD+/NADH的含量可緩解神經退行性疾病[17]。Akt信號通路是細胞內重要的促存活信號通路，Akt磷酸化水平增加可對抗神經元凋亡并促進神經元存活，Akt已被證實參與PD發病過程[18]。有研究表明，PD患者黑質致密部Akt水平降低[19]。本研究顯示，MPP+降低PC12細胞NAD+含量和NAD+/NADH比值，而天麻素和異鉤藤堿聯合應用提高了PC12細胞NAD+含量和NAD+/NADH比值。異鉤藤堿單獨或與天麻素聯合均增加了PC12細胞Akt磷酸化水平。Akt在天麻素和異鉤藤堿聯合應用提高細胞NAD+含量和NAD+/NADH比值中發揮重要作用。

綜上所述，本研究明確了天麻素與異鉤藤堿聯用具有協同作用，可以更好的抑制PD相關的神經元凋亡，其機制可能與改善線粒體功能有關，但是聯用體外協同神經保護作用需要在體內實驗驗證，以及其協同神經保護的分子機制有待進一步研究。