死亡受體4 基因多態性與HBV 相關原發性肝癌的遺傳易感性研究

謝珍 莫翠菊 彭契六* 張磊 謝乃亮

（廣西國際壯醫醫院檢驗科1，廣西 南寧，530201）

（廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科2，廣西 南寧，530021）

肝癌是我國第四位常見惡性腫瘤及第三位腫瘤相關致死性病因，嚴重威脅人民的生命健康[1]。慢性HBV 感染是導致肝癌的最常見原因，但其具體致病機制尚未明確。新近研究顯示，肝癌的發生具有遺傳易感性[2-4]，而細胞凋亡異常與HBV 感染相關的慢性肝臟疾病的發生、發展密切相關[5-6]。DR4 是體內重要的促細胞凋亡因子，是腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)的功能性受體，通過與TRAIL 結合而激活細胞內caspase 級聯反應并將凋亡信號傳遞至細胞內，選擇性誘導已突變的靶細胞凋亡，對多種腫瘤的發生、發展具有重要影響[7-8]。既往研究報道，DR4 基因多態性與前列腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部腫瘤等多種癌癥具有相關性[9-12]，其中報道較多的包括rs20575、rs20576 等功能性單核苷酸多態性（SNP）位點。并且，有學者發現DR4rs20575 和rs20576 基因多態性與丙型肝炎病毒（HCV）感染相關HCC 的遺傳易感性相關[13-14]。然而，目前DR4 基因多態性對HBV 相關HCC 的潛在影響尚未明確。因此，本研究將探討DR4rs20575 和rs20576 兩個SNP 位點的多態性與HBV 相關HCC 易感性之間的關系，為臨床對肝癌的早期診斷和防治提供分子生物學的理論依據。

1.資料與方法

1.1 研究對象

連續收錄2017 年07 月至2018 年06 月在廣西醫科大學第一附屬醫院就診的HBV 相關HCC 的患者為肝癌組，健康體檢者為對照組。納入標準：所有肝癌患者均符合《原發性肝癌診療規范（2017 年版）》[1]對肝癌的診斷標準，且有明確的慢性HBV感染證據，即HBsAg 陽性半年以上和（或）HBV DNA>1 x 103 IU/L。排除標準：（1）合并其他部位惡性腫瘤的患者；（2）合并甲型肝炎、丙型肝炎等其他肝炎病毒感染的患者；（3）合并酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、代謝性肝病及華支睪吸蟲感染等肝臟疾病的患者；（4）合并其他嚴重內科疾病的患者。對照組為來自體檢中心的健康體檢志愿者，HBsAg 陰性，無心、肺、腦、肝、腎及代謝性疾病等病史。本研究中所有納入對象均簽署知情同意書，并且獲得廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準。

1.2 標本采集及全基因組DNA 的提取

抽取研究對象空腹靜脈血2ml 置于EDTA-K2 抗凝管中，使用康寧生物科學（吳江）有限公司的AxyPrep 血基因組DNA 試劑盒提取基因組DNA，應用分光光度計檢測器濃度和純度，稀釋至50ng/ul 后置于-80℃冰箱保存備用。

1.3 DR4 兩個位點基因型檢測

采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism,PCR-RELP）技術檢測DR4 基因rs20575 和rs20576 的多態性。引物由廣州擎科生物技術有限公司設計、合成并純化，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 反應體系及反應條件

使用25ul PCR 反應體系，12.5ul Premix TaqTM（寶生物工程有限公司），上、下游引物各1ul，DNA 模板10ul，滅菌去離子水0.5ul。94℃預變性5min，94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，循環34 次，隨后72℃延伸10min。

1.5 PCR 擴增產物電泳

制備2%瓊脂糖凝膠，將擴增產物置于5×TBE 電泳緩沖液中，在120V 穩定電壓下電泳35min，在凝膠成像分析系統下觀察結果并保存圖像。

1.6 PCR 擴增產物酶切電泳

使用30ul 限制性內切酶反應體系，滅菌去離子水17ul，10×FastDigest 2ul，PCR 擴增產物10ul，限制性內切酶1ul，rs20575 和rs20576 位點的限制性內切酶分別為AdeI 和TaqI，分別置于37℃和65℃中孵育30min。將制備好的凝膠放入電泳槽中，加入0.5×TBE 緩沖液，依次將DNA Marker、酶切產物、陰性對照（未加酶）加入凝膠孔中。在120V 穩定電壓下電泳35min，在凝膠成像分析系統下觀察結果并保存圖像。隨機抽取每個位點10%的PCR 擴增產物，送至廣州擎科生物技術有限公司進行測序，以驗證限制性內切酶切基因分型結果的可靠性，測序結果運用Chromas 軟件進行分析。

1.7 統計學方法

采用SPSS23.0 統計軟件處理數據，應用擬合優度χ2 檢驗分析各組中的基因頻率分布是否符合哈- 溫平衡(Hardy-weinberg equilibrium，HWE)定律。計量資料用±S表示，計數資料用χ2 檢驗或Fisher 確切概率法檢驗，比值比（Odds ratio，OR）和95%可信區間（Confidence Intervals，CI）表示各基因型與HCC 易感性的相關性。P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組研究對象臨床資料比較

在2017 年7 月至2018 年6 月間，符合入選標準的肝癌組患者147 例，其中男110 例（84.62 %，女37 例（15.38 %），平均年齡（46.87±10.61）歲；對照組患者147 例，其中男110例（77.94%），女37 例（22.06%），平均年齡（45.91±11.08）歲，兩組患者的性別比例和平均年齡差異無統計學意義（P >0.05）。

2.2 DR4 兩個SNP 位點的多態性與HBV 相關HCC 的關系

經檢驗，兩組受試者DR4 基因rs20575、rs20576 兩個位點的基因頻率均符合哈溫遺傳平衡規律，具有群體代表性。肝癌組rs20575 位點含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）的攜帶頻率明顯高于對照組（ 31.97% vs 12.24%,OR =3.37,95%CI:1.84-6.16, P = 0.00），而rs20576 位點含突變等位基因C 的基因型（AC+CC）的攜帶頻率在兩組中的分布均無明顯差異(P >0.05)。可以認為，與基因型CC 相比，含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）的患者罹患HBV 相關HCC 的風險增高3.37 倍，而DR4rs20576 位點多態性與HBV 相關HCC 的患病風險無關。詳見表2。

表2 DR4 兩個位點的基因型分布頻率及其與HBV 相關HCC 的關系

2.3 DR4 基因兩個SNP 位點的單倍體分析

通過SHEsis 軟件對rs20575 和rs20576 兩個位點的多態性進行單倍體構建，共構建出CA、CC、GA、GC 四種單倍型。其中CA 和GA 單倍型在兩組中的分布頻率具有顯著差異(OR =0.41,P = 0.00;OR = 3.08,P = 0.00)，可以認為，CA 單倍型患HBV 相關HCC 的風險顯著降低至0.41，而GA 單倍型患HBV相關HCC 的風險顯著升高3.08 倍。CC 和GC 單倍型與HBV 相關HCC 患病風險均無關。見表3。

表3 DR4 兩個SNP 的單倍體構型在對照組和實驗組的頻率比較

3.討論

人類TRAIL 基因是腫瘤壞死因子超家族成員之一，定位于3 號染色體長臂2 區6 帶，是人體重要的免疫效應分子和促細胞凋亡因子，其通過與TRAIL 相關受體結合而選擇性誘導病毒感染細胞、腫瘤細胞及其他突變細胞發生凋亡而達到免疫監視功能，但不能誘導正常細胞凋亡[15-16]。DR4 是TRAIL 受體家族成員之一，定位于染色體8p21 上，該位點具有多個SNP，rs20575和rs20576 是亞洲人群DR4 常見的功能位點。如rs20575 的等位基因C 突變為G，其編碼的蘇氨酸將變為精氨酸，rs20576 的等位基因A 突變為C，其編碼的谷氨酸將變為丙氨酸，這兩個位點中任一位點的基因突變都可能導致TRAIL 與DR4 復合物形成區域內的空間構象發生變化，使TRAIL 介導的凋亡通路障礙，突變細胞不能被及時清除，從而誘導疾病的發生[17-18]。

既往研究報道，DR4 rs20575 和rs20576 兩個SNP 位點多態性與多種腫瘤及自身免疫性疾病相關[9-12,19-20]。Teng 等[21]對高加索人群的研究顯示，DR4 rs20575 基因多態性增加頭頸部鱗狀細胞癌的罹患風險。K?rner 等[13]對德國人群開展的研究顯示，DR4 rs20575 和rs20576 多態性增加HCV 相關肝癌的罹患風險。另一項針對埃及人群的研究則發現[14]，DR4rs20575 位點多態性與HCV 相關肝癌相關，而rs20576 位點多態性與HCV 相關HCC的遺傳易感性無明顯相關。本研究中，rs20575 位點中含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）在肝癌組中的頻率明顯高于健康對照組（P<0.05），與CC 基因型相比，（CG+GG）基因型患HBV相關HCC 的風險升高3.37 倍，而DR4rs20576 位點含突變等位基因C 的基因型（AC+CC）的攜帶頻率在肝癌組與對照組中的分布無明顯差異(P >0.05)。研究結果與既往結果相似，提示rs20575 位點多態性增加了HBV 相關肝癌的遺傳易感性，（CG+GG）基因型是HBV 相關肝癌的危險因素。既往研究報道[21-22]，死亡受體4(rs 20575)基因多態性存在明顯的種族差異，歐美高加索人群中該位點的突變率較高，而亞洲人群中則普遍較低，本研究中兩個SNP 位點中純突變基因型的出現頻率均偏低，因此有待擴大樣本量進行進一步研究。

目前普遍認為，腫瘤的發生、發展常是由多個遺傳變異SNP位點多態性共同作用的結果。單倍型是指一個染色單體中具有統計學相關性的一類SNPs，由于一個基因上存在數個SNP 位點，因此聯合分析同一基因的多個位點的多態性能獲得更全面的遺傳信息，從而更有利于發現基因與疾病的相關性[23]。本研究將DR4 rs20575 和rs20576 兩個位點的基因多態性進行單倍體構建，結果顯示，CA 單倍型患HBV 相關HCC 的風險顯著降低至0.41，而GA 單倍型患HBV 相關HCC 的風險顯著升高3.08 倍。進一步支持rs20575 位點基因突變與HBV 相關HCC 的遺傳易感性相關。

綜上所述，DR4 rs20575 位點基因多態性增加HBV 相關肝癌的遺傳易感性，含突變等位基因G 的基因型（CG+GG）是罹患HBV 相關HCC 的危險因素，但由于HBV 相關肝癌的發病機制極其復雜，該基因位點的具體致病機制有待今后進一步研究。