煙草胚胎發育晚期豐富蛋白家族的全基因組鑒定與分析

吳輝 耿偉博 宗浩 劉文濤 高強 徐后娟 侯欣 唐恒

摘要 在煙草中鑒定了45個LEA家族成員與7個亞組。系統發育分析表明，NtLEA家族成員之間具有較高的同源性，染色體分析顯示，NtLEA家族成員在染色體分布上偏好性較小;NtLEA家族成員結構上具有相似性。通過對煙草LEA基因家族進行全基因組的鑒定與分析，為進一步闡明NtLEA作用和提高煙草在非生物脅迫下的抗性提供基礎。

關鍵詞 LEA基因家族;煙草;抗逆性;生物信息學

中圖分類號 Q-943.2? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）13-0098-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.024

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Genome Wide Identification and Analysis of Abundant Protein Family in Late Embryonic Development of Tobacco

WU Hui1，GENG Wei bo1，ZONG Hao2 et al

（1.College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018; 2.Linyi Tobacco Limited Conpany of Shandong Province，Linyi，Shandong 276000）

Abstract In this study，45 LEA gene family members and 7 subgroups were identified in tobacco.Phylogenetic analysis showed that the members of the NtLEA family had high homology.Chromosome analysis showed that the members of NtLEA gene family had less preference in chromosome distribution.In addition，NtLEA family members are similar in structure.In this study，we conducted a bioinformatics analysis of the tobacco LEA gene family，which is helpful in understanding its resistance and genetic breeding in tobacco.

Key words LEA gene family;Tobacco;Stress resistance;Bioinformatics

胚胎發育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant，LEA）是在高等植物胚胎發育后期、伴隨著脫水干燥過程形成的一類低分子量（大部分為10～30 kD）的蛋白質[1-2]。LEA蛋白最早在棉花的胚胎發育后期分離得到[3]，進一步研究表明，LEA蛋白在其他植物組織（根、幼苗、芽）也具有豐富的表達[4-5]。LEA蛋白基因家族成員是具有重復的氨基酸基序和傾向于α螺旋結構的親水性蛋白[6]，同時亞細胞定位分析表明，LEA蛋白主要位于細胞核和細胞質[7]。根據LEA蛋白質序列的同源性與特異性將其劃分為7個不同的組，分別為LEA1、LEA2、LEA3、LEA4、LEA5、dehydrin和SMP（種子成熟蛋白），但目前缺乏明確的LEA蛋白的通用分類標準[1，8]。

LEA蛋白在植物正常生長以及在干旱、鹽堿、寒冷等非生物脅迫下保護過程中發揮著重要作用[9]，同時也可以作為分子伴侶來抵抗細胞損傷[10]。前人研究表明，LEA基因家族是ABA依賴和非依賴信號通路的主要下游基因，其中大多數在小麥幼苗的抗凍性中起到協同調控的作用[11]。將松樹LEA基因導入大腸桿菌，大腸桿菌表現出更強的耐鹽性、耐熱性和活力，說明LEA蛋白在脅迫下對細胞起保護作用[12]。另外，谷子中的LEA_1亞家族中的5種LEA蛋白在干旱脅迫過程中發揮著重要作用[13]。將小麥LEA（WCOR410）基因在草莓中表達，轉基因草莓葉片的抗寒性得到顯著提高[14]，而將大麥的LEA（HVA1）轉入水稻與小麥后能顯著提高其耐鹽性和抗寒性[15-16]。

目前，已有大量關于LEA基因結構與功能的報道，同時在多種植物中LEA基因家族得到鑒定，如歐洲油菜[17]、毛果楊[18]、小麥[19]、玉米[20]、黃瓜[21]等。然而，目前仍缺乏對煙草LEA基因家族進行全基因組分析與鑒定。煙草是世界上重要的經濟作物，也是科研中重要的模式作物。隨著測序技術和比較基因組學的發展，大量植物基因組被釋放、大量植物基因功能被鑒定，對利用模式信息進行作物改良奠定了良好的基礎[22]。該研究基于煙草K326基因組信息，對煙草LEA基因家族進行理化性質分析、染色體定位、系統進化與基因結構分析，以期為煙草LEA基因家族調控和功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源 煙草K326數據（基因組序列文件、基因組注釋文件與蛋白質序列文件）下載于茄科基因組數據庫（ftp：//ftp.solgenomics.net/）。擬南芥LEA基因家族蛋白質序列文件下載于擬南芥信息資源數據庫（http：//www.arabidopsis.org/）。

1.2 煙草LEA基因家族的鑒定及理化性質分析

以擬南芥LEA基因家族為模板，利用BLASTp（設置（E-value<1e-5）進行多重序列比對，得到候選煙草LEA基因家族成員（NtLEA）候選成員。利用NCBI數據庫 CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具對NtFBA候選成員進行保守域鑒定，最終確定NtLEA基因家族成員。利用蛋白質分析工具ExPASy （http：//cn.expasy.org/tools）對NtLEA家族成員進行蛋白質長度（aa）、分子量（MW）、等電點（pI）和親水性的均值（GRAVY）預測。

1.3 煙草LEA基因家族染色體定位

利用煙草K326基因組注釋文件確定NtLEA染色體位置，利用Mapchart 2.3.2進行染色體定位作圖。

1.4 煙草LEA基因家族系統進化及基因結構分析 利用ClustalW 軟件對NtLEA基因家族成員進行序列聯配。將聯配結果導入MEGA X[23]中，利用鄰位相接法（NJ）構建NtLEA進化樹。默認的自舉值（Bootstrap analysis）設置為1 000個重復，其他參數均設置為默認值。利用在線工具GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn /）進行基因結構分析。

2 結果與分析

2.1 煙草基因組LEA的鑒定及系統發育

以擬南芥的全部LEA基因家族成員為模板，利用BLASTP與NCBI的CD-Search功能確定煙草中45個NtLEA家族成員，并根據系統發育分析命名為NtLEA_1～NtLEA_45。利用NJ法對45個NtLEA基因家族成員進行系統進化樹的構建（圖1），并根據NtLEA家族的結構域將NtLEA家族成員分成7個亞組：LEA_1（NtLEA_1～NtLEA_8）、LEA_2（NtLEA_9～NtLEA16）、LEA_3（NtLEA-17～NtLEA-20）、LEA_4（NtLEA_21～NtLEA23）、LEA_5（NtLEA_24～NtLEA_26）、Dehydrin（NtLEA_27～NtLEA_36）、SMP（NtLEA_37～NtLEA_45），并且7亞組的數量分別是8、8、4、3、3、10、9個，其中NtLEA_37和NtLEA_40同源性最高，共同位于SMP亞組中。

2.2 NtLEA基因家族的分子特征

利用ExPASy，對NtLEA家族成員進行基本信息和理化性質進行分析，結果見表1。45個NtLEA家族成員平均長度為198 aa（76～460 aa）;平均分子量為21.24 kD（8.02～49.31 kD）;LEA 1～7個亞組的平均等電點分為8.49、4.89、10.07、5.87、5.36、6.41、5.94。親水性最大值為0.061，其余均為負值，說明大部分NtLEA家族蛋白質大部分為親水性蛋白質。

2.3 NtLEA基因家族染色體信息

根據NtLEA基因家族鑒定結果信息，利用Mapchart 2.3.2進行染色體定位作圖。經軟件分析可知，45個NtLEA基因家族成員分布在41條染色體區段上（圖2）。

2.4 NtLEA基因家族的基因結構 為了研究NtLEA基因家族的進化分組以及結構的特異性，利用GSDS在線軟件對NtLEA基因的CDS、內含子等進行可視化展示（圖3）。結果顯示，45個NtLEAs基因家族成員具有結構的相似性，同時7個亞組具有差異性。45個NtLEAs基因家族的CDS結構具有1～3個，內含子數量為0～2個。LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、dehydrin中CDS的數量大都為2個，其中NtLEA_11與NtLEA_16含1個CDS。SMP亞家族CDS數量均為3個。

3 討論

越來越多的證據證明基因家族在植物的代謝、發育中起著不可或缺的作用。LEA蛋白在植物界中廣泛存在，其編碼基因在被子植物、裸子植物、苔蘚植物、蕨類植物、藻類中均有克隆，甚至在部分動物、酵母、細菌及真菌中也有發現[24]。

該研究采用生物信息學方法對煙草LEA基因家族進行家族成員的鑒定、系統發育分析、分子特征的鑒定、染色體定位和基因結構分析。結果表明，在煙草中共鑒定出45個NtLEA基因家族成員，分布在LEA所有的亞組當中，共7個亞組。相同亞組中NtLEA成員具有進化的相近性，其中NtLEA_37和NtLEA_40進化關系最近。同時，相同的LEA亞組成員具有高同源性與相似的分子特征（等電點、分子量等）。NtLEA基因家族在染色體上分布廣泛、偏好性較小，同時具有相似的基因結構，說明NtLEA基因家族具有功能的特異性與相似性。LEA蛋白在植物正常生長以及在干旱、鹽堿、寒冷等非生物脅迫下保護過程中發揮著重要作用[9]。NtLEA家族蛋白具有親水性的特點，可能與煙草對干旱等脅迫的應答有關。煙草胚胎發育晚期豐富蛋白家族基因可能是重要的抗性基因，研究煙草胚胎發育晚期豐富蛋白及相關基因，對煙草抗性育種具有重要意義。

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