毒死蜱降解菌的馴化篩選及高活性毒死蜱降解菌群的構建

孫孝文 劉誠 王慧敏

摘要 [目的]通過對3種活性污泥的長期馴化、微生物多樣性分析及優勢菌篩選與復配，構建一種對毒死蜱具有高降解活性的菌群。 [方法]以農藥公司的3種不同廢水處理工序的污泥為材料，利用毒死蜱長期脅迫馴化以獲得高效降解毒死蜱的活性污泥;隨后，在馴化后的3種活性污泥中篩選優勢菌株，并以篩選的菌株構建復合菌群用于毒死蜱的降解。[結果]以毒死蜱為碳源，在馴化后的活性污泥中篩選到3株具有毒死蜱降解活性的菌株（Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2、Serratia MLCs-1），并對3種菌株進行復配，構建了復合菌群MLCF7。復合菌群MLCF7對100 mg/L毒死蜱降解率達82.84%。 [結論]復合菌群對毒死蜱具有高降解活性，表明其在農藥污染生物修復中具有應用潛力。

關鍵詞 毒死蜱;活性污泥;脅迫馴化;復合菌群;生物降解

中圖分類號 X-172? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）13-0064-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Domestication and Screening of Chlorpyrifos degrading Bacteria and Construction of Composited Flora with High Chlorpyrifos degrading Capacity

SUN Xiao wen1，2，LIU Cheng2，WANG Hui min1

（1. Hubei Key Laboratory of Environmental and Health Effects of Persistent Toxic Substances， Institute of Environment and Health， Jianghan University， Wuhan，Hubei 430056;2. School of Life Sciences， Hubei University，Wuhan，Hubei 430062）

Abstract [Objective] Based on three activated sludges， through long term domestication， analysis of microbial diversity， and dominant bacteria screening and composition to construct a composited flora with high chlorpyrifos degrading capacity. [Method]Using sludge from 3 different wastewater treatment processes of pesticide companies as materials，the chlorpyrifos long term stress domestication was used to obtain activated sludge that efficiently degrades chlorpyrifos;subsequently， the dominant strains were screened from the three domesticated activated sludges， and the screened strains were used to construct a complex flora for the degradation of chlorpyrifos.[Result] Using chlorpyrifos as a carbon source， three dominant bacterial strains （Paracoccus MLCa 1， Klebsiella MLCp 2， and Serratia MLCs 1） were screened from these domesticated activated sludges when chlorpyrifos as the carbon source. A chlorpyrifos degrading flora was constructed by composition of these three dominant bacterial strains. The degradation capacity of the composited flora MLCF7 was reached 82.84% towards 100 mg/L chlorpyrifos. [Conclusion] The easily constructed composited flora MLCF7 has high degradation activities to chlorpyrifos， indicating it has the application potential for bioremediation of pesticide contamination.

Key words Chlorpyrifos;Activated sludge;Stress domestication;Composited flora;Biodegradation

毒死蜱是一種有機磷廣譜殺蟲劑，廣泛應用于經濟作物的病蟲害防治[1-2]。作為一種乙酰膽堿酯酶（AChE）的抑制劑，毒死蜱可以結合AChE并使其失去分解乙酰膽堿的能力，導致大量乙酰膽堿積累，從而使中樞神經系統功能喪失，最終導致昆蟲和哺乳動物死亡[3-4]。毒死蜱在農業上的大量持續使用，導致其在土壤和水中過量累積，從而對環境造成了嚴重的污染[1，5]。目前，已報道多種處理毒死蜱污染的方法，相較于傳統的物理化學方法（紫外光解、fenton 氧化法、臭氧氧化法和多相光催化降解等[6-9]），微生物修復法具有高效、廉價、無二次污染等特點，被認為是安全有效的毒死蜱環境污染修復方法[10]。現已發現了一些來源于毒死蜱污染的土壤或者水體的毒死蜱降解菌株，包括Enterobacter、Pseudomonas、Serratia、Klebsiella、Bacillus、Paracoccus、Sphingopyxis、Ochrobactrum、Shewanella和Tistrella等[11-17]。相比單一微生物，復合菌群由于包含更健全的毒死蜱降解代謝基因，可有效避免降解途徑中中間產物積累且對環境具有更強的適應性，更適合毒死蜱環境污染的修復。Vidya等[18]報道了來源于農藥污染的土壤菌群（包含P.aeruginosa、B.cereus、Klebsiella sp.、S.marscecens）可以在30 d完全降解50 mg/L。Barathidasan等[19]報道了一種由Cellulomonas fimi 和Phanerochaete chrysosporium組成的菌群可以完全礦化毒死蜱，且其效果強于單種菌株。因此，開發新的毒死蜱降解菌群，將對毒死蜱農藥污染修復有著積極意義。該研究使用來源于農藥公司廢水處理工序的3種污泥，利用毒死蜱長期脅迫馴化以獲得高效降解毒死蜱的活性污泥;隨后，在馴化后的3種活性污泥中篩選優勢菌株，并以篩選的菌株構建了復合菌群用于毒死蜱的降解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 活性污泥。3種活性污泥分別采集于湖北省農藥公司中農藥制備污水處理的不同工序。活性污泥MLCa采集于好氧池I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V（1∶1∶1∶1∶1比例混合）;活性污泥MLCp采集于推流曝氣反應池;活性污泥MLCs采集于SBR反應器。

1.1.2 主要試劑。毒死蜱標準品（純度≥99.0%）、3，5，6-三氯-2-吡啶醇（TCP）（純度≥99.0%）購于Aladdin（中國，上海）。色譜級乙腈、二氯甲烷（純度≥99.8%）購于MREDA（中國，北京）。

1.1.3 培養基。LB培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，pH 7.0～7.2。MSM培養基：Na2HPO4 5.8 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 7.0～7.2。馴化補料培養基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.4 g，pH 7.0～7.2。

1.2 毒死蜱脅迫下活性污泥的馴化

將新鮮采集的3種活性污泥分別按30%的沉降比接種到含有90 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，并補加50 mL滅菌的馴化補料培養基，使錐形瓶中液體的總體積為200 mL。28 ℃、150 r/min條件下進行馴化7 d后，靜置過夜，倒出50 mL馴化體系上清，補加50 mL 新鮮的馴化補料培養基，并添加5 mg毒死蜱脅迫進行下一輪馴化。此后，后一輪馴化體系比前一輪毒死蜱添加量遞增5 mg。循環馴化20次后，維持每輪100 mg毒死蜱添加量不變，繼續馴化4次，結束馴化。

1.3 活性污泥微生物多樣性檢測

1.3.1 活性污泥取樣。分別取3種活性污泥不同馴化時期（初始樣品，第10輪馴化樣品和最終馴化樣品）的活性污泥樣品各5 mL，8 000 r/min離心10 min去上清，活性污泥沉淀送至派森諾生物科技股份有限公司（中國，上海）進行微生物多樣性分析。每個樣品取3組平行樣。

1.3.2

活性污泥微生物多樣性檢測及分析。微生物多樣性測序平臺為Illumina MiSeq。使用QIIME v1.8.0[20]對獲得的高通量測序數據剔除不可靠的序列。對得到的序列進行合并，按97%的序列相似度對操作分類單元（OUT）進行劃分;選取每個OTU中最豐富的序列作為OTU的代表序列。然后利用每個OUT的代表序列進行分類狀態識別和系統發育分析。使用Chao1和Shannon指數考察微生物群落的Alpha多樣性。使用R軟件，對豐度前50位的屬進行聚類分析并繪制熱圖。使用Metastats[21]分析樣品之間在屬水平上豐度的差異（P值<0.05具有統計學差異）。采用基于加權UniFrac距離的主坐標分析方法（PCoA）對群落相似性進行多維分析[22]。

1.4 毒死蜱檢測

1.4.1 HPLC法毒死蜱濃度標準曲線繪制。色譜級乙腈配制0、50、100、150、200和250 mg/L的毒死蜱溶液，使用高效液相色譜儀LC-20A（SHIMADZU，日本）測定毒死蜱的濃度。色譜柱為Hypersil ODS-C18 反向色譜柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）。流動相為乙腈∶水=70∶30，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進樣20 μL。檢測波長290 nm，毒死蜱的保留時間為7.8 min，峰面積和毒死蜱濃度呈正相關，回歸方程為峰面積= 9 951×毒死蜱濃度-22 414（R2=0.998）。

1.4.2 樣品中毒死蜱含量的檢測。取含毒死蜱溶液5.0 mL，加入2 倍體積的二氯甲烷萃取2次，回收下層有機相溶液，經無水Na2SO4 脫水后，在烘箱中吹干，并重溶于5.0 mL的乙腈中。預試驗顯示，萃取的回收率達90%。使用上述液相條件檢測，并根據毒死蜱標準曲線計算樣品中毒死蜱濃度。

1.5 毒死蜱降解菌的篩選與鑒定

1.5.1 毒死蜱降解菌的初篩。 將馴化后的活性污泥在初篩培養基I（MSM培養基添加100 mg/L毒死蜱）上進行劃線分離;挑取生長良好的單菌落過夜活化，然后再在初篩培養基Ⅱ（MSM培養基添加200 mg/L毒死蜱）上進行劃線分離;再將生長良好的單菌落過夜活化，最后在初篩培養基Ⅲ（MSM培養基添加500 mg/L毒死蜱）上進行劃線分離，最終得到能夠以500 mg/L毒死蜱為碳源生長的菌株。

1.5.2 毒死蜱降解菌的復篩。將上述分離的菌株過夜活化，按1%接種量接種于含100 mg/L 毒死蜱的MSM 液體培養基中，28 ℃、150 r/min培養7 d，8 000 r/min離心10 min檢測上清液殘留毒死蜱濃度，并計算毒死蜱的降解率：

降解率=（1-Ct/C0）×100%，

式中，Ct為農藥殘留濃度，C0為農藥初始濃度。

1.5.3 毒死蜱降解菌的鑒定。挑取毒死蜱降解菌的單菌落，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR擴增16S rRNA基因序列。PCR 產物回收后與載體pClone007 Blunt Vector 連接，轉化感受態細胞E.coli DH5α后送至武漢擎科生物技術公司進行測序。將測序得到的結果在EzTaxon server 2.1 數據庫[23]中進行比對后，采用CLUSTAL W對16S rRNA 基因序列進行多序列比對，并利用MEGA 6.0 軟件[24]neighbor-joining method構建系統發育樹分析，完成菌株鑒定。

1.6 復合菌群的構建及其降解毒死蜱的效率測定

1.6.1 復合菌群的構建。復合菌群由3 株經過交叉平板劃線培養后沒有拮抗活性的毒死蜱降解菌株組成。將過夜活化的3 株單菌（MLCa-1、MLCp-2 和MLCs-1），按照1∶1∶1 的體積比比例混合，并按1%的接種量將混合菌液接種到新鮮的LB 培養基中。28 ℃、150 r/min培養24 h，即得到復合菌群（MLCF7）。

1.6.2 復合菌群降解毒死蜱的效率測定。將OD600 nm=1.0 的MLCF7按2%的接種量接種到含有100 mg/L毒死蜱MSM 培養基中，28 ℃、150 r/min培養7 d。采用上述HPLC法檢測毒死蜱的降解效率。

2 結果與分析

2.1 馴化后的活性污泥對毒死蜱的降解效果

3種來源于農藥公司污水處理系統不同處理工序的活性污泥，在毒死蜱脅迫下，經過6個月的馴化后，回收了降解活性穩定的活性污泥。馴化后的活性污泥，以1%的添加量添加至含100 mg/L毒死蜱的MSM培養基中，在28 ℃、150 r/min的條件下，培養5 d，檢測毒死蜱降解效率。由圖1可見，隨著培養時間的增加，3種活性污泥對毒死蜱的降解效率也不斷增強。3種活性污泥對毒死蜱的第5天降解效率排序為活性污泥MLCp（100.00%）> 活性污泥MLCs（87.59%）> 活性污泥MLCa（82.34%）。3種馴化后的活性污泥對毒死蜱的降解率均達到了80%以上，說明經過毒死蜱的長期脅迫，活性污泥被成功馴化。

2.2 3種活性污泥在不同馴化時期的微生物多樣性分析

2.2.1 樣本微生物群落的Alpha多樣性。對3種活性污泥在不同馴化時期進行了微生物多樣性分析。樣品包含初始樣品（MLCa-0、MLCp-0、MLCs-0）、第10輪馴化樣品（MLCa-2、MLCp-2、MLCs-2）和最終馴化樣品（MLCa-4、MLCp-4、MLCs-4）。每個樣本重復3次，使用A、B和C區別。

使用Chao1和Shannon指數評價樣本微生物群落的Alpha多樣性。Chao1指數值越大，表明群落的豐富度越高。Shannon指數值越高，表明群落的多樣性越高。由表1可知，3種活性污泥在毒死蜱的長期脅迫下的馴化過程中，微生物群落豐富度和多樣性呈現了不同的變化趨勢。來源于好氧池的活性污泥MLCa在馴化過程中微生物群落豐富度和多樣性均不斷下降;來源于推流曝氣反應池的活性污泥MLCp在馴化過程中微生物群落豐富度不斷下降，多樣性先上升后下降;來源于SBR反應器的活性污泥MLCs在馴化過程中微生物群落豐富度和多樣性均不斷上升。這可能與3種活性污泥原始微生物菌群組成差異有關。

2.2.2 基于UniFrac距離的PCoA主坐標分析。?? 由圖2可知，每個點代表一個樣本，不同顏色的點屬于不同樣本（組），兩點之間的距離越近，表明2個樣本之間的微生物群落結構相似度越高，差異越小。坐標軸括號中的百分比代表了對應的主坐標所能解釋的原始數據中差異的比例。結果表明3種活性污泥在馴化的過程中，微生物群落結構都發生了明顯的變化。菌群MLCp和MLCs馴化后微生物群落結構較為相近，與MLCa馴化后微生物群落結構差異較大。

2.2.3

結合聚類分析的群落組成熱圖。使用R 軟件，對樣本中豐度前50 位的屬進行聚類分析并繪制熱圖。由圖3可知，馴化結束后，活性污泥MLCa 中主要優勢菌群有Paracoccus sp.、Enterobacter sp.和Methylobacillus sp.等;活性污泥MLCp 中主要優勢菌群有Klebsiella sp.、Pseudoxanthomonas sp.和Achromobacter sp.等;活性污泥MLCs 中主要優勢菌群有Serratia sp.、Bacillus sp.和Pseudomonas sp.等。

2.3 毒死蜱降解菌的篩選及鑒定

2.3.1 毒死蜱降解菌的篩選。將3種馴化后的活性污泥在含毒死蜱的MSM固體培養基中經過多次劃線分離篩選，共得到7株可以以500 mg/L毒死蜱為碳源生長的菌株，分別為來源于活性污泥MLCa的MLCa-1和MLCa-2，來源于活性污泥MLCp的MLCp-1、MLCp-2和MLCp-3以及來源于活性污泥MLCs的MLCs-1和MLCs-2。所有毒死蜱降解菌株經過過夜活化后，按2%的接種量接種于含有100 mg/L 毒死蜱的MSM 培養基中，28 ℃、150 r/min培養7 d后，測定了菌株對毒死蜱的降解率。由圖4可知，所有毒死蜱降解菌株對毒死蜱均有降解作用，其中，降解率前三的菌株為MLCa-1（降解率為53.71%）、MLCp-2（降解率為51.85%）和MLCs-1（降解率為65.37%）。

2.3.2 毒死蜱降解菌的鑒定。篩選的毒死蜱降解菌株的16S rRNA基因，經過CLUSTAL W多序列比對，MEGA 6.0構建系統發育樹對菌株進行鑒定。由圖5可知，MLCa-1與Paracoccus bengalensis JJJT的序列相似性為99.40%，MLCp-2與Klebsiella singaporensis LX3T的序列相似性為99.37%，MLCs-1與Serratia nematodiphila DSM 21420T的序列相似性為99.58%。因此將MLCa-1鑒定為Paracoccus sp.，MLCp-2鑒定為Klebsiella sp.，MLCs-1鑒定為Serratia sp.。

2.4 復合菌群MLCF7的構建及其對毒死蜱的降解

2.4.1 MLCF7降解毒死蜱的生長曲線和降解曲線測定。復合菌群MLCF7按1%的接種量接種于含100 mg/L毒死蜱的MSM培養基中，150 r/min培養7 d，監測毒死蜱的降解率。由圖6可知，在7 d的降解過程中，降解體系的菌液OD600 nm不斷上升，第5天后達到穩定期。相應地，在7 d的降解過程中，降解體系降解曲線也呈現不斷的上升趨勢。這表明復合菌群MLCF7可以降解毒死蜱，并利用毒死蜱為碳源生長。在第7天時，復合菌群MLCF7對毒死蜱的降解率達82.84%，由圖4可知，3株單菌對毒死蜱的降解率都在50%～60%。復合菌群對毒死蜱的降解顯著性高于3株單菌對毒死蜱的降解率。結果表明，3株單菌存在協同作用，提高了對毒死蜱的降解能力。

2.4.2 復合菌群MLCF7降解毒死蜱中間代謝產物研究。使用HPLC法檢測第1天、第3天、第7天復合菌群MLCF7降解毒死蜱體系代謝產物，由圖7可知，隨著降解時間增長，毒死蜱濃度不斷下降，中間產物TCP的濃度先上升后下降，直至消失。因此，復合菌群MLCF7 首先將毒死蜱降解成TCP，再進一步地TCP 被降解成其他的小分子物質。

3 結論與討論

對3種來源于農藥公司廢水處理系統的污泥進行毒死蜱長期脅迫下的馴化，得到了3種對100 mg/L毒死蜱降解率達80%以上的活性污泥。對3種活性污泥馴化的過程進行微生物多樣性分析，發現毒死蜱脅迫下3種活性污泥的菌群發生了明顯的變化。其中，副球菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷式菌屬等菌屬在馴化的過程中被富集。通過以毒死蜱為碳源，在馴化后的活性污泥種篩選了3株毒死蜱降解細菌Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2和Serratia MLCs-1。以3種毒死蜱降解細菌構建了復合菌群MLCF7，對100 mg/L毒死蜱降解率達82.84%。

3種毒死蜱降解菌對毒死蜱的降解活性較低，但復合后降解活性明顯增加，這種協同機制需進一步研究。復合菌群MLCF7降解毒死蜱會形成中間產物TCP，然而TCP如何繼續被降解，也需進一步研究。復合菌群MLCF7構建簡單，易循環構建使用，可避免活性污泥降解易退化的問題，在農藥污染生物修復中具有應用潛力。

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