紅掌花青素合成相關基因的研究進展

俞政男 馮欣潔 張志勝 曾瑞珍 謝利 郭和蓉

摘要 紅掌是僅次于蘭花的第二大熱帶觀賞植物。佛焰苞顏色是紅掌育種的主要目標性狀，與其所含的花色素種類和含量密切相關。研究表明，花青素是影響紅掌花色的主要色素之一，其生物合成受結構基因和調節基因的共同調控。綜述了紅掌佛焰苞中花青素生物合成相關結構以及調節基因克隆和功能研究進展，為紅掌花色的分子育種提供指導。

關鍵詞 紅掌;花青素;結構基因;調節基因;分子育種

中圖分類號 S682.14? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）13-0005-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.002

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress of Anthocyanin Biosynthesis Related Genes in Anthurium andraeanum

YU Zheng nan，FENG Xin jie， ZHANG Zhi sheng et al

（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642）

Abstract Anthurium andraeanum is the second largest tropical ornamental plant after orchid. The color of spathe is the main target character in Anthurium andraeanum breeding， which is closely related to the anthocyanin type and content. The results show that anthocyanins are one of the main pigments affecting Anthurium andraeanum spathe color， and its biosynthesis is regulated by both structural and regulatory genes. In this paper， the research progress of anthocyanin biosynthesis related structure and regulatory gene cloning and function in anthocyanin biosynthesis in Anthurium andraeanum was reviewed， which could provide guidance for molecular breeding of anthocyanin biosynthesis in Anthurium andraeanum.

Key words Anthurium andraeanum;Anthocyanin;Structural gene;Regulator gene;Molecular breeding

紅掌（Anthurium andraeanum）是天南星科（Araceae）花燭屬（Anthurium）植物，原產于哥倫比亞，是世界上銷量僅次于蘭花的第二大貿易花卉[1]。因其具有較高的觀賞價值，深受消費者喜愛。佛焰苞是紅掌的主要觀賞部位，其造型獨特，色彩艷麗，以紅色、粉色、橙色、珊瑚色和白色為主，還有紫色、綠色、褐色和復色等[2]。研究表明，影響紅掌佛焰苞呈色的色素主要是花青素、黃酮、黃酮醇和葉綠素，其中，花青素是佛焰苞中最主要的色素[3]。

花青素又稱花青素苷（anthocyanin），是植物類黃酮代謝的中間產物，屬有色類黃酮一族，主要累積在葉片、花瓣、果實表皮細胞的液泡內，是構成植物花和果實的主要色素之一[4]。花青素的合成受兩類基因的共同調控，一類是編碼花青素生物合成途徑中各種酶的結構基因;另一類是通過編碼轉錄因子來調控結構基因時空表達的調節基因，調控花青素的種類和數量。目前，已經鑒定和克隆出部分與花青素合成相關的結構基因和轉錄因子。該研究擬綜述紅掌花青素合成相關基因的研究進展，揭示紅掌佛焰苞顏色形成的機制，為紅掌花色改良提供參考。

1 花青素與紅掌花色形成

花青素具有類黃酮C6-C3-C6的C骨架的典型結構，由于花色基團在結構中R1和R2位置上的取代基不同，形成了花青素的顏色差異[5]。目前已知的花青素種類超過550種，最常見的有6種：矢車菊色素（cyanidin）、天竺葵色素（plelargonidin）、飛燕草色素（delphinidin）、芍藥花色素（peonidin）、牽牛花色素（petunnidin）和錦葵色素（malvidin）[6-7]。矢車菊素通常使花瓣呈現紅色或粉紅色，天竺葵色素呈現橙紅色，飛燕草色素呈現藍色，這3種色素通常單獨存在于不同的花中。牽牛花色素、芍藥花色素和錦葵色素均是以上3種色素不同程度甲基化作用的產物[8-9]。由于花青素在植物體內的存在不穩定，常與葡萄糖、半乳糖、蕓香糖等單糖結合形成花青素苷[4]。花青素苷的化學性質不穩定，會隨pH的變化而變化，酸性條件下花色呈紅色、紫色，堿性條件下花色呈藍色[10]。

紅掌佛焰苞最主要的顏色是紅色系（包含粉色）和橙色系（包含珊瑚色），由天竺葵色素和矢車菊色素控制[11-12]。當只有天竺葵色素存在時，佛焰苞呈橙色和珊瑚色;天竺葵色素和矢車菊色素同時存在時，佛焰苞則呈紅色和粉色，且橙色和紅色佛焰苞中的花青素濃度均高于珊瑚色和粉色佛焰苞[13]。除了花青素之外，紅掌色素還包括葉綠素、類胡蘿卜素、黃酮和黃酮醇等化合物。淡黃色和白色佛焰苞色素的主要成分是黃酮和黃酮醇類化合物，綠色佛焰苞中的主要色素是葉綠素，類胡蘿卜素只存在于少部分棕色佛焰苞和肉穗花序中[14]。研究表明，佛焰苞中的花青苷含量越高，顏色越偏向紅色;葉綠素含量越高，佛焰苞顏色越綠;2種色素同時存在時佛焰苞會呈現棕紅色[3]。由于紅掌佛焰苞中缺少飛燕草色素或芍藥花色素，因此目前還沒有發現藍色佛焰苞的紅掌品種。

2 紅掌花青素生物合成途徑與相關基因研究

花青素的生物合成受到結構基因和調節基因的共同調控[15]，作為植物類黃酮途徑的一個分支，花青素生物合成途徑研究得比較透徹。目前已經從矮牽牛（Petunia hybrida）、非洲菊（Gerbera jamesonii）、石竹（Dianthus chinensis L.）、金魚草（Antirrhinum majus L.）等花卉中分離和克隆出一些結構基因和調節基因[16]。根據紅掌佛焰苞中花青素合成相關基因的研究結果，參考擬南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牽牛（Petunia hybrida）等模式植物的花青素生物合成途徑，繪制出紅掌的花青素生物合成途徑（圖1）。花青素生物合成分3個階段，第1階段是苯丙烷途徑，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）等酶的作用下生成花青素的合成前體——香豆酰輔酶A;第2階段是類黃酮代謝，查爾酮合成酶（CHS）催化合成柚皮素查爾酮，啟動花青素的合成，經過類黃酮3-羥化酶（F3H）的催化生成二氫黃酮醇;第3階段是花青素的生成，二氫黃酮醇在類黃酮3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）的作用下生成各種無色花青素，再經過花青素合成酶（ANS）的催化生成花青素[17]，最后經過類黃酮3-O-糖基轉移酶（UFGT）催化為穩定的花青素苷[18]。無色花青素和花青素也可能分別經過LAR和ANR催化生成原花青素。

2.1 結構基因

2.1.1 C4H（cinnamic acid 4 hydroxylase）。

C4H 是苯丙烷代謝途徑上的重要調控酶，催化肉桂酸生成4-香豆酸。除了花青素合成途徑外，C4H還是原花青素途徑、木質素途徑等不同次生代謝途徑上的關鍵基因[20]，在植物生長發育過程中發揮著重要作用[21]。研究表明，AnC4H在紅掌各組織中均有表達但主要集中在佛焰苞中，與佛焰苞花青素含量呈正相關[22]。用乙烯利處理能夠提高AnC4H的表達量，從而促進花青苷的累積[23]，進一步說明AnC4H基因在佛焰苞花青素合成過程中起正向調控的作用[23]。

2.1.2 CHI（chalcone isomerase）。

CHI 是類黃酮物質代謝途徑上的第2個關鍵酶[24]。研究發現，CHI基因具有組織表達特異性，在花青素含量高的植物組織中表達量較高，其表達水平也會隨著發育階段的變化有所不同[25]。利用RNAi技術抑制煙草CHI基因的表達，查爾酮含量上升，花瓣呈現黃色[26];矮牽牛中CHI基因發生突變后花粉會因查爾酮的積累而成黃色或綠色。相反，提高CHI的活性會使黃酮類化合物含量顯著上升[27]。研究表明，AnCHI的表達具有組織差異性和時空特異性，其在佛焰苞中的表達量明顯高于根、莖和肉穗花序，并且在佛焰苞早期的表達量高于成熟期，AnCHI基因表達量與花青素的含量呈正相關，表明AnCHI基因可能是控制佛焰苞花青素合成的關鍵基因，在花青素的合成過程中起正向調控作用[28-29]。但也有研究認為由于CHI屬于類黃酮生物合成的上游基因，不僅參與花青素的合成還參與了所有類黃酮化合物的合成，因此CHI的表達量變化與紅掌佛焰苞花色的相關性不高[30]。

2.1.3 F3H（flavonone 3 hydroxylase）。

F3H位于花青素合成途徑上的中樞位點，既可以催化無色的二羥基黃烷酮生成二氫黃酮醇，也可以生成黃烷酮醇。F3H可以單獨調控花青素的合成，但大多情況下都是與CHS等酶共同催化黃酮類化合物的生成。通過改變植物體內的F3H基因的表達量可以對植物體內的花青素進行調節，進而改變花色，在花青素的合成和累計中具有重要作用[31]。Collette等[32]最早獲得了紅掌F3H的全長序列，并發現F3H與CHS、ANS共同調控紅掌花青素的合成。佛焰苞中F3H的表達量下降將導致二氫黃酮醇等下游產物含量降低，表明F3H是改變紅掌佛焰苞顏色的關鍵基因[33]。在部分紅掌品種中，F3H表達量的增加會使佛焰苞的明度增加，紅色減弱[14]。此外，當植物面臨逆境脅迫時，F3H能夠促進體內花青素的積累，提高抗氧化能力，從而抵御逆境。

2.1.4 F3H和F35H（flavonone 3-hydroxylase and flavonone 35-hydroxylase）。

F3H催化二氫黃酮醇生成的二氫槲皮黃酮是合成紅色矢車菊色素的重要中間產物，對粉色和紅色花的形成具有重要作用[34]。在一個突變為橙色的佛焰苞中發現，F3H在突變部位的表達量下調，矢車菊色素的含量也大幅下降，突變佛焰苞中累積的色素主要是天竺葵色素，證明F3H是控制紅掌佛焰苞呈現紅色的關鍵基因[35]。通過控制F3H基因的表達，可以改變紅掌佛焰苞中矢車菊色素的累積，對于改良佛焰苞顏色具有重要意義。

F35H是合成飛燕草色素、牽牛花色素、錦葵色素的關鍵酶，催化生成的二氫楊梅黃酮是合成飛燕草類花青素的前體物質，缺乏F35H就無法形成藍色，因此F35H也被稱為藍色基因[36]。F35H自然界中天然藍紫色花卉較少，石竹、玫瑰、郁金香等花卉都沒有藍色品種，因此克隆F35H基因為培養出藍色的花卉提供了可能[34]。如果將F35H轉入植株內，可以提高飛燕草色素的累積，改變花色素的組成，從而改良花色[37]。目前，在紅掌中未發現F35H基因表達的研究。

2.1.5 DFR（dihydroflavonol 4 reductase）和ANS（anthocyanidin synthase）。

DFR和ANS是花青素合成末期的關鍵酶，共同將二氫黃酮醇催化為有色花青素，對花色最終形成起了決定性的作用[38-39]。DFR在進化過程中高度保守，并且具有組織表達特異性和時空表達特異性[40]。由于DFR對底物有特異性，表達水平不同，植物顏色各異。失去DFR活性的植物突變體會變成象牙色或白色，將DFR異源轉入白色的康乃馨（Dianthus ‘Carnation）中，花瓣變為紫色;橙花龍膽（Gentiana scabra Bunge）中的DlaDFR1和DlaDFR2過表達會使矢車菊色素含量降低，顏色偏紅[19，41]。作為花青素合成途徑中的關鍵節點基因，DFR常被用于植物的紅花分子育種中[38]。研究發現AnDFR在早晨和傍晚的佛焰苞中表達量偏高，中午最低，因此其表達具有晝夜節律[42]，AnDFR在佛焰苞中的表達量與花青素含量的變化趨勢一致，表明AnDFR基因的表達量與佛焰苞花青素的含量呈正相關[43]。ANS在花器官中的表達量高于根、莖、葉等組織，在顏色較深或者鮮艷的部位中表達量也顯著高于其他部位。ANS的過表達會增加花青素的累積，表達量降低會導致花青素含量的減少。NtANS1和NtANS2在煙草花成熟期的表達量增加，發育后期降低;藍豬耳（Torenia concolor Lindl.）中ANS的缺失會導致花由藍色變為白色[44-45]。研究發現，ANS與DFR在佛焰苞中的表達量越高，佛焰苞的顏色越紅[30]，是紅色花色遺傳模型相關的關鍵基因[46]。

2.1.6 ANR和LAR（anthocyanidin reductase and leucoanthocyanidin reductase）。

ANR（花青素還原酶）是合成原花青素的關鍵酶，該酶可直接將花青素催化生成原花青素，而不經過UFGT（類黃酮糖基轉移酶）的催化生成穩定的花青素苷，因此ANR基因與花青素的合成競爭同一底物，在花青素的合成途徑中有負調控的作用[47]。LAR（無色花青素還原酶）是植物類黃酮化合物合成途徑中的一個關鍵酶，催化無色花青素轉化為兒茶素[48]，LAR由ANR經過MYB轉錄因子家族基因共同調控。目前已經在擬南芥、茶樹、芒果等植物中克隆得到了LAR基因[49]。

最早在擬南芥中發現ANR對種皮的顏色起負調控作用[50]，缺少ANR基因會促進花青素的合成[51]。研究發現ANR在紅色系的佛焰苞中表達量較低，在白色系的佛焰苞中表達量較高，表明ANR基因的表達量與花青素的含量呈負相關，推測ANR可能是調控紅掌佛焰苞中原花青素合成的關鍵基因[52]。LAR與DFR共同影響無色花青素的合成[53]，ANR和LAR基因表達會促進原花青素的合成，減少花青素的累積，對花青素的累積起負調控的作用，可能是調節紅掌佛焰苞花青素和原花青素平衡的關鍵酶[30]。但ANR和LAR如何作用于佛焰苞花青素的合成有待進一步研究。

2.2 調節基因

調節基因編碼轉錄因子，轉錄因子與結構基因啟動子中相應的順式作用元件結合，從而調控結構基因的時空表達[16]。研究發現，對花青素合成途徑中的結構基因起調控作用的轉錄因子主要有3類：MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白[54]。研究表明，紅掌花青素合成主要受R2R3-MYB家族基因和 bHLH家族基因調控。Elibox等[55]認為紅掌佛焰苞顏色受到M、O、R 3個顯性基因控制，R基因編碼一個轉錄因子，調控CHS、F3H、ANS的表達，O基因編碼一個單獨的轉錄因子調控DFR的表達。顯性的O和R產生有色佛焰苞，O和R只要有一個為隱性則產生白色佛焰苞，M基因調控F3H基因決定佛焰苞屬于紅色系還是橙色系。O和R的調控機制尚未被證實，很有可能代表MYB家族和bHLH家族的轉錄因子[56]。

2.2.1 R2R3-MYB轉錄因子。

MYB蛋白屬于DNA結合蛋白，具有一段高度保守的MYB結合域，其結構域由52個氨基酸構成，其中有高度保守的氨基酸和間隔序列，這些保守的氨基酸使MYB蛋白結構域折疊成HHTH（helix-helix-turn-helix）結構[57]。根據R基序數目的不同，可以將MYB蛋白分為R2R3 MYB、1R MYB、3R MYB、4R MYB。其中，R2R3 MYB是花青素合成途徑中最廣泛的調控因子，能夠激活一個或多個結構基因的表達[58]，在決定花青素的著色方式中起關鍵作用[59-60]。現已從百合（Lilium brownii var.）、月季（Rosa chinensis Jacq.）、玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）等植物中分離并鑒定出參與花青素合成調控的R2R3 MYB轉錄因子[58，61]。

大部分R2R3 MYB轉錄因子對花青素的累積有促進作用。Collette[42]克隆得到了紅掌第一個R2R3 MYB轉錄因子——AaMYB1，將AaMYB1和調控玉米花青素合成的bHLH基因ZmLc轉入白色花的大花蕙蘭（Cymbidium hybrid），花瓣出現含有花青素的斑點[62]。AaMYB1轉入煙草后得到花青素顯著累積的轉化體[63]。AaMYB1的單獨過表達導致煙草積累大量花青素，同時使花青素合成的關鍵基因NtDFR、NtANS和R2R3 MYB基因NtAn2表達量大幅上升，表明AaMYB1具有正調控花青素合成的功能[64]。Li等[65]研究發現AaMYB2轉錄因子與AaF3H、AaANS、AaCHS等基因的表達規律一致，推測AaMYB2在紅掌佛焰苞花青素累積中起正調控的作用。也有一些R2R3 MYB轉錄因子對花青素的累積起抑制作用。如AaMYB3單獨表達或與AabHLH1共同作用時，轉基因煙草花瓣中的花青素含量會減少，而原花青素含量上升，導致花色變淺，證明AaMYB3對花青素的合成起負調控作用[66]。

2.2.2 bHLH（basic helix loop helix）。

bHLH是根據其蛋白保守結構域命名的一類轉錄因子家族，主要調節類黃酮和花青素合成以及參與植物的生長發育、生理代謝和逆境應答等[67]。在花青素合成途徑的轉錄調控過程中，bHLH通常與MYB蛋白共同起作用，MYB負責結合和活化轉錄的功能，bHLH負責增強MYB蛋白結構的穩定性和轉錄活性。bHLH和MYB之間的相互作用是花青素合成途徑調控研究的新熱點[8，66]。Jiang等[68]研究發現紅掌葉色突變體會累積大量花青素并且葉色更綠、抗逆性更強，將分離得到的AaMYB3和AabHLH35基因轉入擬南芥中，能夠提高其抗寒性和抗旱性，證明AabHLH35在花青素合成累積和提高植物抗性方面具有重要作用。并不是所有的bHLH調節基因都對花青素的累積起促進作用，也有一些起抑制作用。比如玉米中缺失bHLH基因的突變體中，UFGT基因的表達量上升，花青素苷的含量也隨之上升;Ph MYB27與矮牽牛bHLH蛋白JAF13、AN1結合時，會導致花青素的合成受到抑制[69]。

3 問題與展望

紅掌花青素的研究取得了一定的進展，已經從紅掌中克隆和分離得到了一些與花青素合成相關的結構基因和調節基因，有利于科研工作者通過遺傳改良等方法使紅掌花青素的合成和累積朝著市場需求的方向發展。目前，已經克隆出來的與紅掌佛焰苞顏色相關的基因有PAL、C4H、CHI、CHS、F3H、DFR、ANR、LAR、AaMYB1、AaMYB2、AaMYB3、AabHLH35等，但是與模式作物相比，紅掌的花青素合成途徑以及調控網絡還不夠明確，花青素的合成代謝過程也非常復雜，還需要進一步完善。此外，在一些模式植物中發現花青素合成受到3類轉錄因子（MYB轉錄因子家族基因、bHLH轉錄因子家族基因和WD40蛋白家族）的調控，這3類轉錄因子相互作用，共同調控花青素的合成。但是在紅掌中尚未報道有關WD40蛋白家族的研究，這類蛋白對紅掌花青素的合成是否有影響還需要進一步研究。

佛焰苞的顏色是紅掌育種工作者關注的重要性狀。目前主要通過傳統育種方式獲得不同佛焰苞的顏色，但雜交育種花色選擇的目標性不強。開展紅掌花青素合成相關基因功能研究，完善花青素合成途徑的代謝機制，運用到紅掌新品種分子育種研究中，為定向改良和修飾紅掌花色提供新的思路，對紅掌花色育種工作具有一定的指導意義。

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