吐魯番斗雞與新羅曼雞MAOA基因外顯子區遺傳多態分析

劉秀霞，廖凱，任艷，廖和榮

(石河子大學，新疆 石河子 832000)

單胺氧化酶A(MAOA)是去甲腎上腺素(NE)、 5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)的降解酶單胺氧化酶的一個亞型，它參與5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素的代謝，而這些神經遞質異常與行為異常和許多精神障礙類疾病有關[1-5]。有研究表明，MAOA基因與攻擊行為有著密切的聯系[6-8]。攻擊行為是一個復雜的機體活動, 不但與多種遺傳因素的協調作用有關，還和環境因素以及環境與遺傳之間互作相關。人們從基因、環境與行為等方面對MAOA多態性與早期環境對個體攻擊行為帶來的影響做了許多研究[9-11]。目前報道的MAOA基因多態主要有：啟動子區域的單胺氧化酶A串聯重復序列(MAOA-VNTR)[12]，MAOA-LPR低活性等位基因和MAOA-LPR高活性等位基因[13]，第8外顯子MAOA-T941G單核苷酸多態[14]，第14外顯子MAOA-C1409T多態性等。研究表明MAOA基因的功能多態性與個體的沖動，攻擊和反社會行為有關。最早發現，人MAOA基因的第8外顯子上936位基因C-T錯義突變，導致了患者的行為異常[6]。隨后又發現,MAOA-VNTR短等位基因更可能是個體發生暴力攻擊的“危險基因”[9,15-16]。MAOA基因多態性與攻擊行為的關系已是當前攻擊行為的遺傳基礎研究熱點之一。對人影響攻擊行為相關基因的研究，已取得部分進展,但對于動物的研究還比較少。吐魯番斗雞好斗、骨骼粗壯、身體結實、戰斗力強是研究攻擊行為的良好素材[17]。因此，本試驗根據已經發現的與人攻擊行為相關的基因MAOA，對吐魯番斗雞攻擊行為相關的基因的多態性進行研究，旨在找到與雞爭斗行為相關的基因，從而對動物攻擊行為的遺傳機制進行更進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用石河子大學試驗站的新羅曼雞71只，吐魯番斗雞保種場的斗雞103只。雞翅膀靜脈采集血樣2 mL(ACD抗凝劑)，采用酚-氯仿抽提方法提取基因組DNA，-20 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、瓊脂糖、蛋白酶K購自于北京天根生物科技有限公司；PUC19DNA/MspⅠmakers購自上海生物工程公司；Tris飽和酚、丙烯酰胺(Acrylamide)、過硫酸銨(APS)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、蛋白酶K(protein K)、Trise堿購自德國QIAGEN公司。

1.3 引物設計

根據GenBank登錄號為NC_006088.5雞單胺氧化酶A基因的DNA序列，利用軟件Primer 5.0針對雞MAOA基因的10個外顯子設計10對引物，引物序列見表1(引物由上海生物工程技術服務有限公司合成)。

表1 MAOA基因擴增的引物序列

1.4 PCR產物的克隆與測序

取PCR產物 10 μL與上樣緩沖液(98%甲酰胺、0.025%二甲苯 氰、2%甘油，0.01 mmol/L EDTA)10 μL混合，在 PCR儀上98 ℃變性10 min，迅速置于冰上冰浴 5 min。用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳12～14 h，根據電泳圖譜鑒定基因型。分別取不同基因型個體的PCR產物，經純化回收后連接到T載體上， 轉化B121感受態細胞，以藍斑為對照，挑取陽性重 組菌落，經相同的PCR反應條件鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行雙向測序。

1.5 統計分析

運用DNASTAR軟件，進行基因型頻率和基因頻率檢測、品種內的Hardy-weinberg平衡檢測(X2適應性檢驗)、有效等位基因、雜合度、多態信息含量分析。

2 結果與分析

2.1 PCR產物擴增

PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠檢測,均獲得與目片段大小一致的產物,產物條帶清晰且無雜帶,穩定性和特異性好，可直接進行聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(PCR-SSCP)分析。

2.2 聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(PCR-SSCP)檢測

對MAOA基因的10個外顯子進行多態性檢測,只在引物MAOA1、MAOA2、MAOA5、MAOA7擴增的片段檢測到多態，其中引物MAOA1、MAOA5、MAOA7擴增位點NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)在吐魯番斗雞和新羅曼雞上均檢測到多態，引物MAOA2的擴增位點為NC_006088.5 (30260-30535)只在吐魯番斗雞上檢測到多態。NC_006088.5(25424-25662)經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發現3種基因型:AA、AB、BB(見圖1)。NC_006088.5 (30260-30535)經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發現2種基因型:AA、AB(見圖2)。NC_006088.5(34980-35257)經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發現6種基因型:AA、BC、BB、AB、AC、CC(見圖3)。NC_006088.5(38401-38613)經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發現3種基因型:AA、BB、AB(見圖4)。

圖1 引物MAOA1的SSCP

圖2 引物MAOA2的SSCP

圖3 引物MAOA5的SSCP

圖4 引物MAOA7的SSCP

2.3 測序分析

測序結果表明，MAOA1引物擴增片段的AB型在該片段第T25541C和 G25614T處有突變，BB型在T25541C處有突變見(見圖5)。

圖5 引物MAOA1擴增的片段不同基因型測序結果

MAOA2引物擴增片段的AB型在該片段第T30342C處有突變(見圖6)。

圖6 引物MAOA2擴增的片段不同基因型測序結果

MAOA5擴增片段的AA、AB、AC在T35186G處有突變，BB、BC在G35215T處有突變，BB、CC、BC、AC、AB在T35223C處有突變，CC、AC、BC在G35198A、G30489T和G30470T處有突變，CC、BC在G35199A處有突變，BB型在C35133T出現有突變。上述這些突變位點均為同義突變(見圖7)。

圖7 引物MAOA5擴增的片段不同基因型測序結果

2.4 吐魯番斗雞、新羅曼雞兩種雞群各位點的遺傳多態性檢測結果

表2 NC_006088.5(25424-25662)、 NC_006088.5 (30260-30535)、 NC_006088.5(38401-38613)在不同雞品種的基因型和基因頻率

表3 NC_006088.5(34980-35257)在不同雞品種的基因型和基因頻率

對吐魯番斗雞和新羅曼雞MAOA1、MAOA2、MAOA5和MAOA7引物擴增的基因位點的多態性參數進行分析，結果見表4。

表4 MAOA基因擴增在兩種雞群體中的遺傳特性

吐魯番斗雞和新羅曼雞群體在MAOA1引物擴增的基因位點NC_006088.5(25424-25662)存在兩個等位基因，雜合度分別為0.449、0.456，多態信息含量分別為0.348、0.352(0.250.5)，群體處于高度多態。吐魯番斗雞和新羅曼雞群體在MAOA7引物擴增的基因位點NC_006088.5(38401-38613)存在2個等位基因，雜合度分別為0.494、0.419，多態信息含量分別為0.372，0.302(0.25

3 討論

MAOA可調節中樞神經系統單胺類遞質的水平，對個體的情緒、成癮、沖動、攻擊等起重要作用[18]。茆正洪等[19]的研究認為，MAOA基因rs1137070位點多態性與具有高沖動的反社會人格障礙相關。針對健康的受試者和有攻擊行為的精神分裂癥患者，通過磁共振 (MRI)研究功能MAOA基因多態性對腦組織結構和功能的影響發現，MAOA啟動子區可變數目重復序列多態性的基因型對男性暴力和攻擊行為的影響更顯著[19-20]。本研究中的NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)位點，在吐魯番斗雞和新羅曼雞上均檢測到多態，而NC_006088.5 (30260-30535) 位點只在吐魯番斗雞上檢測到多態，說明NC_006088.5 (30260-30535) 多態性位點可能與斗雞的攻擊行為相關，后面將做更進一步的研究。

一般用多態信息含量來衡量基因片段的多態性。多態信息含量的高低關系到該位點的使用效率和可用性，在一個群體中，一個位點多態信息含量越高說明它的雜合子比例越高，提供的遺傳信息也就越多，根據多態信息含量值一般分為高度多態性(PIC>0.5)、中度多態性(0.25