大腸桿菌O139及其所產志賀樣毒素SLT-IIe對豬臨床相關指征的影響

范永超，劉海隆，施曉杰，張倩，馮波，穆祥*

(1. 北京農學院動物科學技術學院/獸醫學(中醫藥)北京市重點試驗室，北京 102206；2. 海南省農業科學院畜牧獸醫研究所，海南 ?？?571100；3. 中央民族大學藥學院，北京 100081)

仔豬水腫病(edema disease，ED)是一種多發于斷奶仔豬的細菌性疾病，主要由產志賀樣毒素大腸埃希菌(Shiga toxigenicEscherichiacoli，STEC)引起，初步視診可觀察到頭部水腫、腹瀉并伴有共濟失調、站立不穩和驚厥等神經癥狀，剖檢可見腸系膜、胃壁水腫并伴有出血[1]。該病發病急，病死率高且目前尚未有特效藥，極大的影響了仔豬生長發育，嚴重影響了經濟效益。大腸埃希菌O138、O139、O141等血清型可引起該病，其中以O139最為常見[2]。該病主要毒力因子是F18ab菌毛和志賀樣毒素二型變異體(Shiga-like toxin IIe,SLT-IIe)[3]。SLT-IIe是由一個具有酶活性的A亞單位被一個識別特定糖脂受體的B亞單位的五聚體包圍組成的，A亞單位進入宿主細胞發揮細胞毒作用[4]。細菌通過F18ab菌毛定植在小腸上皮細胞并釋放SLT-IIe，SLT-IIe侵害血管內皮細胞，增加血管通透性，促進炎性細胞因子釋放并引發一系列免疫反應，造成以腸道為主的多器官損傷，全身水腫和神經癥狀[4-5]。本試驗以豬為試驗動物進行攻毒和攻菌，通過臨床觀察、病理解剖及組織學觀察，證明該方法成功模擬了自然感染下仔豬水腫病的病理狀態，為基于仔豬水腫病辨證分型新技術的建立和中獸藥的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與毒素

大腸埃希菌CVCC1519，血清型為O139，購自中國獸醫藥品監察所；SLT-IIe由本試驗室提取保存，濃度為721.75 μg/mL。

1.2 主要試劑

蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(批號為C0105)，購自碧云天生物技術公司；4%多聚甲醛(批號為BL539A)，購自西安風騰生物有限公司；注射用生理鹽水(批號為HG/T3491-1999)，購自四川科林藥業股份有限公司；中性樹膠(批號為10004160)，購自四川科林藥業股份有限公司；麥康凱瓊脂培養基由獸醫學(中醫藥)北京市重點試驗室配置保存。

1.3 試驗動物及分組

試驗動物長白一元仔豬(25～30日齡)，購自北京原種豬場。

選體重5～8 kg長白一元斷奶仔豬15頭，適應性飼養3 d。試驗前對斷奶仔豬進行稱重，設3個處理組，每組5只。對照組腹腔注射生理鹽水1.2 mL/kg，毒素組腹腔注射SLT-IIe毒素溶液0.7 mg/kg，細菌組腹腔注射1×1010CFU/mL的菌液1.2 mL/kg。

1.4 臨床指標采集

對各組仔豬進行實時觀測，臨床觀測指標為精神、皮毛色澤、活動、飲食、糞便、舌色。

1.5 病理剖檢及組織學檢測

在病程發展最高峰時，對各組半數仔豬及死亡仔豬進行剖檢取樣，觀察記錄臟器表觀病理變化，剖檢胃、小腸，對其內容物及黏膜進行觀察；取相同部位相同大小的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、空腸、胃進行組織固定，HE染色進行病理組織學檢測。

2 結果

2.1 臨床癥狀

對照組無明顯臨床癥狀，細菌組及毒素組表現出面部水腫、神經癥狀等明顯水腫病特征性癥狀，具體如表1所示。

表1 臨床癥狀

2.2 病理剖檢

由剖檢可見，對照組腸道和胃無明顯病理變化(圖1A、圖1D)；毒素組和細菌組仔豬腹腔有纖維樣滲出及黃色澄明液體，液體暴露于空氣后凝固成膠凍；十二指腸及空腸腸壁腫脹變薄，呈紅褐色，腸內容物為紅棕色黏稠液體，腸黏膜脫落，彌漫性出血，結腸系膜呈透明膠凍樣水腫(圖1B、圖1C)；胃壁水腫，胃黏膜紅腫，嚴重充血、出血，胃底部彌漫性出血，胃內有黃色膠凍，胃黏膜層與肌層易分離，可見水腫液流出(圖1E、圖1F)。

A. 對照組腸道;B. 毒素組腸道;C. 細菌組腸道;D. 對照組胃;E. 毒素組胃;F. 細菌組胃

2.3 病理組織學檢測結果

2.3.1 肝臟

對照組肝臟組織完整，中央靜脈結構清晰，可見清晰的肝小葉和排列整齊的肝索(圖2A)；毒素組肝小葉中央靜脈擴張，充滿紅細胞，肝索紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，肝細胞破裂(圖 2B)；細菌組肝小葉中央靜脈擴張，肝索紊亂，肝臟組織水腫(圖 2C)。

A. 對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

2.3.2 空腸

對照組小腸絨毛清晰可見，未發生脫落，腸黏膜及固有層結構正常(圖 3A)；毒素組小腸絨毛變短、脫落，腸黏膜下層及固有層水腫，炎性細胞浸潤，杯狀細胞增多(圖 3B)；細菌組小腸絨毛變短、脫落，腸固有層水腫及黏膜下層水腫，腸腺結構破壞，可見大量炎性細胞浸潤(圖 3C)。

A. 對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

2.3.3 肺臟

對照組肺臟組織結構正常，肺泡壁分界清晰，未見炎性細胞(圖 4A)；毒素組肺臟組織發生實變，肺泡壁腫脹，炎性細胞增多，間質結締組織增生顯著(圖 4B)；細菌組肺泡病變區發生實變，肺泡壁腫脹，肺泡腔內有中性粒細胞滲出，肺泡中可見脫落的上皮細胞，間質毛細血管擴張。毒素組肺組織發生實變，肺泡壁腫脹，炎性細胞增多，間質結締組織增生顯著(圖 4C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

2.3.4 胃

對照組胃壁黏膜完整清晰，胃小凹組織細胞結構排列整齊(圖 5A)；毒素組胃黏膜腺體和固有層有炎性細胞浸潤，下層結構疏松，結締組織水腫(圖 5B)；細菌組胃黏膜萎縮，結構紊亂，黏膜下層結構疏松，炎性細胞浸潤，結締組織水腫(圖 5C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

2.3.5 脾臟

對照組脾臟組織結構正常，脾索、脾竇分界清晰(圖 6A)；毒素組脾臟組織發生水腫，脾小體結構疏松，充滿粉紅色水腫液，間質細胞增生，吞噬細胞數量增多(圖 6B)；細菌組脾竇擴張，血管壁增厚，血管內有微血栓，部分區域淋巴細胞消失(圖 6C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

2.3.6 腎臟

對照組腎臟組織結構正常，腎小球、腎小管形態清晰(圖 7A)；毒素組腎小球內細胞增生，腎小管上皮細胞腫脹，腎間質炎性細胞浸潤(圖 7B)；細菌組腎小球萎縮，腎小管上皮細胞脫落，大量炎性細胞浸潤(圖 7C)。

A.對照組；B. 毒素組；C. 細菌組

3 討論

仔豬水腫病是三大仔豬大腸桿菌病之一，目前我國還尚未有針對此病的特效藥，治療以青霉素、鏈霉素等抗生素為主并輔以安痛定等支持性藥物[6]。隨著2020年國家全面禁抗，獸用抗生素的全面退出，對于替抗藥物的研發已經迫在眉睫，一個穩定有效的動物模型是藥物研發的重要保障。周宏超等[7]以小鼠為試驗動物，通過腹腔注射107/86大腸埃希菌和SLT-IIe毒素成功復制了仔豬水腫病病理模型。本試驗選取斷奶長白仔豬為試驗動物誘發的仔豬水腫病，更加貼近臨床上仔豬水腫病的病例。結果發現，毒素組與細菌組的臨床表現基本一致，均出現了精神沉郁、共濟失調、肌肉震顫等神經癥狀和典型眼瞼、面部水腫等仔豬水腫特征性癥狀。剖檢發現，毒素組和細菌組仔豬胃腸病變突出，胃大彎和腸系膜均出現嚴重的出血水腫。組織學觀察發現，各臟器細胞均有不同程度腫脹甚至破碎，細胞間出血和炎性細胞浸潤。其中，胃腸細胞病變最嚴重，小腸絨毛萎縮脫落、腸黏膜下層及固有層水腫，胃黏膜萎縮、結締組織水腫。

在已有報道中，對仔豬水腫病的研究大都是圍繞胃腸道進行的[8-10]，在本試驗中，發病仔豬表現出以胃腸道為主的全身多器官損傷。Yang等[11]研究表明，腸道是該病侵襲的靶器官，小腸上皮細胞刷狀緣的F18受體是該病的靶點。SLT-IIe是該病的主要毒力因子，本試驗也進一步證明了這一觀點。SLT-IIe是一種血管毒素，當SLT-IIe被腸道吸收進入血后，與靶內皮細胞糖脂受體結合，去除核糖體28S rRNA上特定的腺嘌呤殘基，使核糖體滅活，從而抑制蛋白質的合成[12]。SLT-IIe還能從微血管內皮細胞細胞核DNA中除去腺嘌呤，造成細胞DNA損傷，引起血管內皮細胞變性壞死，導致全身各器官損傷[13]。綜上所述，仔豬水腫病是一種以內皮細胞受損為核心的“血管內皮疾病”。因此，開發出保護內皮細胞的藥物，理論上可以有效治療仔豬水腫病。

4 結論

本試驗用大腸桿菌O139和SLT-IIe均成功誘發了仔豬水腫病，且SLT-IIe所誘導的發病豬在相關臨床指征上與細菌組誘導的發病豬表現出一致性。研究結果為該病的診斷、預防和治療奠定了科學的理論基礎，并為相關新獸藥的研發提供了靶動物模型。