廣西豬流行性腹瀉病毒感染病例的確診與`病毒S基因變異分析

楊春杰，秦毅斌，陳櫻，韋祖樟，黃偉堅，趙武，歐陽康*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2. 廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530005)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，臨床上該病以水樣腹瀉、脫水以及嘔吐為主要特征[1]。1971年，PED在英國被首次報道，隨后波及世界上多個國家和地區，Debouck和Pensaert首次分離得到PEDV毒株并命名為CV777。2010年，PEDV的變異毒株在我國出現，并迅速在豬群內流行，造成了大規模的PED暴發[2-3]。2013年美洲首次暴發PED，隨后蔓延至加拿大、墨西哥等北美國家，造成仔豬死亡超過700萬頭[4-5]。2014年初，韓國、日本等亞洲國家與中國臺灣地區相繼暴發嚴重的PED疫情。截至目前，PEDV已經席卷亞洲、歐洲、美洲的大部分國家與地區[6-7]，給世界生豬養殖業造成巨大的損失。

PEDV是冠狀病毒科、α冠狀病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒，呈球形，直徑約95～190 nm，病毒基因組全長約為28 kb[8-9]。PEDV的結構蛋白有纖突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白，S蛋白在介導病毒入侵和誘導中和抗體的過程中發揮重要作用[10]，當病毒進入機體后，宿主細胞可以將S蛋白裂解為S1和S2兩個亞基，其中S1亞基有助于識別上皮細胞受體，S2亞基有助于病毒與上皮細胞胞膜的融合[11-12]。一些研究表明，S基因對PEDV的生物學特性有較大的的影響，該基因與PEDV毒株的遺傳進化、毒力改變等有著密切的關系[13-15]。

本研究通過對廣西某規模化豬場腹瀉病例進行臨床診斷，并對感染豬群的PEDV毒株(命名為：CH/GXYL/2018)S基因進行序列測定與分析，為分析廣西地區PEDV遺傳變異情況，以及科學有效地防控PED提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，購自上海百賽生物深圳分公司；AMV反轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；GreenTaqMix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 發病情況與臨床樣品采集

病料來自廣西玉林市某規模化養豬場。該豬場生產母豬存欄規模約1 000頭，2018年10月之前豬場從未使用過腹瀉疫苗，豬場內也未出現過腹瀉疫情。2018年10月1日與2018年11月1日，對母豬群兩次普免豬流行性腹瀉病毒(AJ1102疫苗株)與豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)二聯弱毒活疫苗。11月15日，哺乳舍母豬和14～16日齡的仔豬同時開始出現腹瀉、嘔吐等癥狀，至當月18日左右腹瀉疫情逐漸加重，截止到12月11日，哺乳仔豬發病率約為50%，不同棟舍哺乳仔豬死亡率在5.5%～19.3%之間，保育豬和育肥豬未出現腹瀉疫情。2018年12月16日，無菌采集腹瀉仔豬的小腸送至本實驗室進行病原檢測。無菌條件下取腹瀉仔豬小腸內容物，用PBS溶液進行稀釋，并以5 000 r/min離心5 min，收集上清并于-80 ℃保存備用。

1.3 臨床診斷與病理剖檢

對發病豬群的臨床癥狀進行觀察；對發病死亡的哺乳仔豬進行病理解剖，重點觀察仔豬的胃、小腸和腸系膜淋巴結的病變情況。

1.4 引物設計與合成

參考文獻[16]的方法設計一對PEDV檢測引物，目的片段長度為492 bp；參考文獻[17]設計一對擴增PEDV S基因的引物，目的片段長度為4 430 bp(引物位置參考CHGD-01)，該引物擴增的目的基因片段包含PEDV S基因的全長序列(表1)。引物均由上海杰李生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 病毒RNA的提取及反轉錄

臨床樣品經12 000 r/min 4 ℃ 離心5 min后，按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書抽提病毒總RNA并進行反轉錄，反轉錄體系為：5×Buffer 2.5 μL，dNTP mix 1 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25 μL，RNasin酶抑制劑0.25 μL，下游引物0.5 μL，RNA 8 μL。42 ℃ 反應1 h，cDNA產物于-80 ℃保存備用。

1.6 臨床樣品的PCR檢測

PEDV PCR檢測的反應體系為：GreenTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA模板 3 μL，加ddH2O補至25 μL。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共34個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應結束后，擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時，參考王睿敏等[18]的方法，對引起豬腹瀉的常見病原TGEV、豬輪狀病毒(PRoV)、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)進行RT-PCR檢測。

1.7 S基因PCR擴增與測序

以病毒的cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA 3 μL，加ddH2O至25 μL。擴增條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、53 ℃ 15 s、72 ℃ 50 s，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應結束后，擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將得到的目的片段進行純化，并將純化后的產物送至上海杰李生物技術有限公司進行測序。

1.8 S基因生物信息學分析

應用DNAStar-SeqMan軟件，將測序得到的S基因進行拼接，得到PEDV的S基因全長序列。應用DNAStar-MegAlign軟件，將PEDV S基因序列與GenBank上發表的32條PEDV毒株S基因參考序列(表2)，進行比對分析，并利用Mega 5.0軟件，采用Neighbor-joining方法構建系統遺傳發育進化樹。應用ProtScale軟件分析S蛋白疏水性，應用Protean軟件分析S蛋白抗原指數。

表2 PEDV參考毒株信息

2 結果

2.1 臨床觀察與病理剖檢

經臨床觀察發現，腹瀉仔豬表現為精神沉郁，體型消瘦，體毛凌亂且皮膚多被腹瀉物污染，仔豬多在2～8日齡出現不同程度的腹瀉，新生仔豬最早可在出生當天出現腹瀉，7日齡內的仔豬在發病后3～4 d多因嚴重脫水而死亡。腹瀉仔豬多伴隨嘔吐癥狀，糞便呈灰黃色或灰白色。患病母豬表現為食欲下降、精神不振，但是腹瀉癥狀較輕。腹瀉疫情只出現在產房，耐過后的仔豬死亡率較低。

剖檢腹瀉死亡的哺乳仔豬，在其胃內可見大量的凝乳塊(圖1)，仔豬主要病變為小腸腫脹擴張(圖2)，腸壁變薄并且缺乏彈性，腸系膜充血，在腸道內可見大量的黃色液體，腸系膜淋巴結腫大，小腸黏膜有出血點。

圖1 哺乳仔豬胃內充滿凝乳塊

圖2 小腸腫脹擴張充滿黃色液體

2.2 臨床樣品RT-PCR檢測

對臨床腹瀉樣品進行PEDV RT-PCR擴增，將反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果擴增出492 bp的條帶，與預期目的條帶大小一致(圖3)，說明臨床樣品存在PEDV的感染，同時對TGEV、PRoV和PDCoV進行檢測，結果均為陰性。

M. DL 2000 Marker；1. 陰性對照；2. 陽性樣品

2.3 S基因擴增

以病毒的cDNA為模板，進行PEDV的S基因PCR擴增，得到與預期大小一致的目的條帶(圖4)，將擴增的目的片段進行純化，并將純化后的產物進行測序。測序序列經與NCBI上公布的PEDV參考株序列比對，確認得到了S基因的全長序列,并將其來源毒株命名為CH/GXYL/2018毒株。

M. DL 5000 Marker；1. 陰性對照；2. S基因擴增

2.4 綜合診斷

通過對發病豬群的流行病學調查、臨床癥狀和病理變化的觀察，結合實驗室分子診斷技術等的綜合分析，初步診斷此次疫情是由PEDV感染引起。

2.5 S基因序列分析

2.5.1 S基因同源性與遺傳進化分析

應用DNAStar-SeqMan軟件對CH/GXYL/2018毒株的S基因進行比對和拼接，結果顯示，CH/GXYL/2018毒株的S基因全長4 158 nt，編碼1 385 aa。應用MegAlign軟件，將CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列，與GenBank上發表的32株PEDV參考毒株的S基因核苷酸序列進行同源性分析。結果表明，CH/GXYL/2018與國內外參考毒株S基因比對，核苷酸同源性為92.8%～99.5%，氨基酸同源性為91.8%～99.2%(表3)。CH/GXYL/2018與中國疫苗株AJ1102的S基因核苷酸同源性為98.9%，與中國廣東GD-A株S基因核苷酸同源性高達99.5%，與廣西地區分離株CH-GX-2015-750A的S基因核苷酸同源性為97.4%，而與ZJU-G1-2013毒株的核苷酸同源性僅為92.8%。

表3 S基因同源性比對結果

用CH/GXYL/2018與GenBank上發表的國內外PEDV參考毒株，構建S基因核苷酸遺傳發育進化樹，結果如圖5顯示。PEDV毒株形成兩個較明顯的分支，分為G1與G2型，廣西毒株CH/GXYL/2018與國內PEDV疫苗株AJ1102在同一個分支上，與FL2013、GD-A毒株的遺傳距離較近，與經典疫苗毒株CV777(vaccine)和Attenuated-DR13親緣關系較遠。遺傳進化分析表明，CH/GXYL/2018屬于G2-a變異毒株。

▲為本試驗獲得的S基因序列；●為疫苗株S基因序列

2.5.2 S基因突變位點分析

應用MegAlign軟件，將CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列與中國G2型疫苗參考株AJ1102進行比較，結果發現，CH/GXYL/2018毒株的S基因共有37個核苷酸發生了突變，共造成14個氨基酸變異。將廣西地區CH/GXYL/2018毒株的S基因氨基酸與19株國內外PEDV參考毒株進行比較，結果顯示，CH/GXYL/2018與中國G2型疫苗參考株AJ1102有多處相同的氨基酸突變位點，分別為369位氨基酸處(T→I)、492位氨基酸處(R→T)、501位氨基酸處(I→T)、1 212位氨基酸處(F→Y)、1 220位氨基酸處(S→G)、1 270位氨基酸處(P→S)。比對結果中沒有發現S基因氨基酸的插入或缺失，S基因氨基酸主要突變位點為：216位氨基酸處(M→I)、768位氨基酸處(P→R)、1 242位氨基酸處(D→E)，在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸處，CH/GXYL/2018的氨基酸突變與參考毒株均不相同(表4)。

表4 S基因氨基酸主要突變位點分析

2.5.3 S蛋白疏水性與抗原性分析

應用ProtScale軟件，對CH/GXYL/2018的S蛋白的疏水性進行分析。結果發現，S蛋白在第1 336 aa位點的疏水性數值最大，為3.978；在第1 210 aa位點的疏水性數值最小，為-2.611。與參考毒株中的AJ1102相比，S蛋白第807位氨基酸從絲氨酸突變為異亮氨酸，第827位氨基酸從谷氨酰胺突變為組氨酸，而導致該區域的疏水性發生了較大的變化(圖6)。

A. CH/GXYL/2018 S基因疏水性；B. AJ1102 S基因疏水性

應用Protean軟件，根據Jameson-Wolf方法預測CH/GXYL/2018 S蛋白抗原指數，并與國內外發表的5株G2型PEDV參考毒株S蛋白抗原指數進行差異性分析。分析結果顯示，由于氨基酸的突變，廣西地區CH/GXYL/2018毒株的S蛋白抗原指數在800～813 aa區域發生了明顯的改變，說明廣西地區CH/GXYL/2018毒株在該區域的抗原性發生了較大變化(圖7)，與參考毒株中的AJ1102相比，CH/GXYL/2018的抗原性在767～772 aa區域也出現了變化。

圖7 S蛋白抗原指數預測分析結果

3 討論

自PEDV被發現以來，該病毒給世界上很多國家和地區的生豬養殖業帶來了巨大的沖擊。截止目前，PED的流行范圍進一步擴大，給豬群健康造成較大的威脅。本研究通過臨床觀察、病理解剖以及實驗室RT-PCR檢測，對廣西玉林市某規模化豬場豬群腹瀉進行了確診，綜合分析發現，本次疫情是由PEDV變異株感染哺乳母豬和哺乳仔豬所引起的。流行病學調查顯示，雖然豬場曾對母豬群兩次普免PEDV與TGEV二聯弱毒活疫苗(PEDV疫苗株為AJ1102)，但是豬群依然出現了PEDV變異株感染的疫情，表明疫苗并沒有對豬群提供完全保護。通過對本案例分析發現，豬群第2次普免二聯弱毒活疫苗的時間為產前一周之內，母豬上產房后，PEDV抗體水平沒有得到有效提升，仔豬不能得到有效保護，疫苗的免疫時機也可能是造成這次疫情出現的重要因素。2018年10月之前豬場沒有腹瀉發生，豬場環境中PEDV的含量很低，通過必要的消毒措施進行控制，加上合理的飼養管理，可以給豬群提供日常保護。通過腹瀉疫苗對豬群的普免，能夠很好地建立起豬群的免疫屏障，但是一旦部分豬群免疫水平低下，PEDV對豬群形成有效感染，發病豬群向環境中排放大量的病毒，豬的抗體難以抵抗大劑量強毒攻擊時就會形成豬群發病[19]。另外調查發現，在豬群發病期間，當地有連續多天的陰雨天氣，晝夜溫差較大，環境突變也可能是PED暴發的影響因素。疫病發生后，豬場并沒有果斷采取消滅傳染源、切斷病毒在單元間的傳播途徑等措施，從而導致了PEDV在場區的傳播。

PEDV的S蛋白能夠誘導機體產生中和抗體，在病毒粒子通過膜融合入侵到宿主細胞的過程中發揮關鍵作用，S基因的突變還能夠引起PEDV的不斷進化與病毒毒力的改變[20-21]。根據PEDV S基因N末端結構域的不同，可以將PEDV分為G1與G2型[22]。本研究在遺傳進化分析中發現，CH/GXYL/2018與FL2013、GD-A有著較近的遺傳距離，屬于PEDV G2-a變異型毒株。氨基酸突變位點分析顯示，CH/GXYL/2018與中國G2型疫苗參考株AJ1102也有多處相同的氨基酸突變位點，但是在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸處，廣西CH/GXYL/2018毒株的氨基酸突變與參考毒株均不相同，至于這些突變位點對病毒致病性的影響，尚有待于進一步深入研究。核苷酸同源性分析顯示，CH/GXYL/2018與疫苗株CV777的核苷酸同源性僅為93.2%，在59～62位氨基酸處CH/GXYL/2018有氨基酸的連續插入，在159～160位氨基酸處存在氨基酸的缺失，與前人的研究結果相似[23-26]。CH/GXYL/2018與廣東毒株GD-A的核苷酸同源性達到99.5%，并且多處氨基酸突變位點相一致。另外，本研究還對S蛋白的疏水性和抗原指數進行了預測分析，結果顯示，CH/GXYL/2018的變化位點多集中在800～827位氨基酸處，這與氨基酸突變位點分析相一致，推測CH/GXYL/2018的S蛋白結構在此處發生了較大的變化。

隨著PEDV在世界各國和地區之間流行范圍的不斷擴大，毒株出現了不同程度的變異，目前變異株疫苗在養豬生產中已得到了廣泛的應用，但是由于該病毒變異進化較快[27]，免疫失敗的案例依然時有發生。在對PED的防控中，及時開發并應用與PEDV流行毒株相一致的疫苗依然具有重要意義。由于PEDV感染后沒有很好的治療方法，實際生產中應以預防為主，建立完善的豬場生物安全體系尤為必要。豬流行性腹瀉多發生在氣溫寒冷的冬春季節，因此，生產中應注意冬春季節仔豬的防寒保暖，加強對仔豬的飼養管理，提升豬群的抵抗力，從根源上杜絕PEDV對豬群的感染。