薩福克羊血清激素與超數排卵效果的相關性研究

趙冰茹，陳童，董紅，毋狀元，羅永明，季斐,4，鄭新寶*

(1. 中國農業大學動物科技學院，北京 100193；2. 新疆畜牧科學院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆阿勒泰地區畜牧獸醫站，新疆 阿勒泰 836501；4. 新疆農業大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

胚胎移植技術在充分發揮優良母畜繁殖潛力、縮短世代間隔、提高良種化進程及保存品種資源方面具有重大意義。超數排卵技術是胚胎移植中的一項關鍵技術[1-2]，通過注射外源性激素來提高血液中促性腺激素濃度，減少閉鎖卵泡數量，從而使卵泡發育并排卵。該技術能夠為胚胎移植提供大量優質胚胎，是優質種羊進行快速繁育的有效途徑[3]，因此研究影響超數排卵的因素對于改善超排效果具有重要意義。

目前，已發現供體羊生理狀態、激素水平、超排方案、年齡和胎次等均對超數排卵存在影響[4]。其中與超數排卵密切相關的激素主要是促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黃體激素(luteinizing hormone，LH)，卵泡生長需要FSH和LH的作用才能繼續發育，在超數排卵中只有有腔卵泡才可以在外源促性腺激素刺激下發生排卵，而有腔卵泡卵泡腔的形成、生長依賴于FSH和LH[5-6]，由此可見FSH和LH對超數排卵的效果有重要影響。抗繆勒管激素(anti-müllerian hormone，AMH)是一種糖蛋白激素，是反映卵巢儲存卵泡數量的內分泌標記，而AMH也是由超數排卵中可被外源性促性腺激素誘導發育的卵泡群所分泌，故而可以利用AMH預測供體母畜的超排效果[4]。但是目前關于動物內源性FSH、LH和AMH水平對超數排卵效果影響的報道較少，因此，為了解血清中激素水平對超數排卵效果的影響，本研究測定了薩福克母羊血清中FSH、LH和AMH激素水平，分析其與超數排卵效果的相關性，為改善綿羊超數排卵效果提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物均來自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司種羊場，隨機選擇了60只2～4歲的健康、無繁殖疾病的薩福克羊作為供體母羊。所有試驗動物超排前1個月根據供體母羊膘情進行補飼，每只母羊每天精料添至800 g、胡蘿卜200 g、苜蓿草2 kg，青貯玉米2 kg，配備舔磚，精料中添加亞硒酸鈉等微量元素。進行必要的防檢疫和驅蟲工作。

1.2 藥品和試劑

用于同期發情和超數排卵的藥品和試劑有注射用氯前列烯醇鈉(PG)、垂體促卵泡素(FSH)、促黃體素釋放激素A3(LHRH)，均購自寧波市三生藥業有限公司。采卵液為自配，胚胎保存液(Holding)為美國AB公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1 同期發情

試驗時間為2018年10月，觀察供體母羊體況及繁殖周期，確定體況良好、無疾病和不良癥狀后，開始同期發情和超數排卵處理。供體羊同期發情方法為注射氯前列烯醇鈉(PG)1 mL/只(0.1 mg)，1 d后，試情公羊開始試情，3 d內確定發情的羊作為試驗羊。將發情羊分為3組，按照發情日開始超數排卵處理。使用FSH減量法對供體母羊進行超排，在發情周期的第11天開始，每天早晚各注射1次FSH，連續注射4 d，第1、2、3、4天的注射劑量分別為4 mg/d、3 mg/d、2 mg/d、1 mg/d，每只羊總劑量為10 mg；在超數排卵第3天時，注射1支PG(0.1 mg)，在母羊發情后14 h進行腹腔鏡輸精，并注射促排卵素3號(LHRH-A3)1支(25 μg)；在供體母羊發情配種的6～7 d，進行手術法沖胚，同時統計黃體數、回收胚胎數、可用胚胎數等數據。

1.3.2 樣本采集

超排前1 d(即發情周期第10天)，采集外周血樣品，經3 000 r/min離心10 min后分離出血清，-20 ℃下冷凍保存，用于測定LH、FSH和AMH。

1.3.3 激素測定

血清激素指標的測定均委托專業檢測機構進行，采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附(ELISA)方法，儀器型號: ST-360酶標儀，靈敏度強(最低檢測濃度小于1.0 pg/mL)、準確度高(標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.99)、特異性強(不與其他可溶性結構類似物交叉反應)、重復性好(板內變異系數小于10%、板間變異系數小于15%)。使用UNICEL DXI800全自動發光儀檢測FSH、LH濃度水平，使用Iflash3000全自動化學發光儀檢測血清中AMH濃度水平。

1.4 統計分析

使用SPSS 19.0軟件進行LH、FSH和AMH與沖胚效果的相關性分析，并建立回收胚胎數與血清激素間的最優回歸模型。

2 結果

2.1 血清激素指標及排卵數統計

由表1可知，薩福克供體母羊的沖胚數據中，平均黃體數為11.00個，平均回收胚胎數、平均可用胚胎數分別為10.30個、6.12個，可用胚率為0.58。測得血清中LH、FSH、AMH含量的均值分別為1.47 ng/L、17.91 U/L、8.13 ng/mL。

表1 超數排卵效果和血清激素指標的統計分析

2.2 血清激素指標及超排效果相關性分析

對薩福克母羊血清中LH、FSH、AMH與黃體數、回收胚胎數、可用胚胎數、可用胚率進行相關性分析，結果表明見表2。LH與黃體數呈顯著正相關(P<0.05)，與回收胚胎數、可用胚胎數均呈極顯著正相關(P<0.01)，LH與可用胚率無顯著相關關系(P>0.05)；FSH與回收胚胎數、可用胚胎數均呈極顯著正相關(P<0.01)，與黃體數、可用胚率均無顯著相關關系(P>0.05)；AMH與黃體數呈顯著正相關(P<0.05)，與回收胚胎數、可用胚胎數均呈極顯著正相關(P<0.01)，AMH與可用胚率無顯著相關關系(P>0.05)。

表2 血清激素與薩福克羊沖胚數據間的相關系數

2.3 建立最優回歸模型

利用血清激素對回收胚胎數進行逐步回歸分析，根據回歸分析原理，回歸模型R2越接近1時，該回歸模型越接近實測值，從表3可看出，所建立回歸模型中，模型3的R2最接近于1，因此該模型為最優回歸模型。從表4中發現，AMH(X1)、FSH(X2)在回歸模型中對回收胚胎數影響極顯著(P<0.01)，LH(X3)在回歸模型中對回收胚胎數影響顯著(P<0.05)，因此可得出最優回歸模型為Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，該模型R2為0.914，而表5方差結果顯示，該模型呈極顯著(P<0.01)水平，表明由AMH、FSH、LH和回收胚胎數建立的回歸模型具有統計學水平的顯著，說明該回歸模型可用于利用血清激素指標評估回收胚胎數。

表3 回收胚胎數和血清激素回歸分析后模型

表4 回歸模型回歸系數參數估計值

表5 回歸模型方差分析

3 討論

3.1 超數排卵效果分析

胚胎移植技術是家畜快速擴繁中的重要技術，而超數排卵作為其關鍵技術對于快速繁殖優良種畜十分重要[7]。在動物發情周期的一定階段，注射超過體內正常量的促卵泡激素類激素，可以拯救99 %即將閉鎖的卵泡，使其能夠進行正常發育成熟，同時在排卵前注射LH類激素，以此彌補動物體內源性LH的不足，從而使成熟卵泡可以同時排出[8]。

本研究使用FSH減量法對薩福克供體母羊進行超數排卵處理，獲得平均可用胚胎數為6.12個，這與茍想珍等[9]超數排卵處理黑頭薩福克羊獲得6.08個平均可用胚胎數的結果相似，而Song等[10]利用褪黑素處理過的供體母羊獲得的平均可用胚胎數為7.40個，略高于本研究，這可能與褪黑激素能夠顯著提高胚泡率有關[12]。對部分個體由于出現帶膿、粘連等原因無法統計出黃體數，以及部分激素檢測異常的數據，進行了剔除。

3.2 血清激素與超排效果的相關性

FSH和LH對與卵泡的生長發育是必不可少的，同時在超數排卵中也是十分重要的促性腺激素。其中FSH的主要功能在于其對卵巢卵泡發育的調控[12]，其通過促進對顆粒細胞和卵丘細胞的增殖分化、代謝以及類固醇等的合成，進而發揮對卵泡發育調控的功能。Sirard等[13]研究發現促卵泡素對于體內、體外卵母細胞發育能力的獲得有著重要作用；Khan等[14]在體外培養的卵丘卵母細胞復合體中發現，FSH能夠誘導卵母細胞生發泡的破裂，而Dinopoulou等[15]研究發現，FSH能夠起到改善卵母細胞發育能力的作用。LH在正常的生殖周期中起到恢復成熟卵泡中卵母細胞減數分裂的作用。研究表明，LH通過誘導表皮類生長因子的表達，以及相關信號通路的激活等方式對卵母細胞的成熟以及排卵發揮著重要作用[16-17]，即LH通過其所介導的細胞旁分泌和自分泌的方式，調節卵巢內生殖細胞的變化。綜上所述，FSH和LH在卵泡發育及排出中起著不可或缺的作用，在本研究中血清FSH、LH與超數排卵效果的相關性分析發現，FSH、LH與回收胚胎數呈強正相關(0.7≤R<1)，與可用胚胎數也呈中度正相關關系(0.4≤R<0.7)，表明LH、FSH均對回收胚胎數和可用胚胎數有著很大影響。

AMH也被稱為繆勒管抑制物質，是轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員，是由睪丸未成熟的 Sertoli 細胞及卵巢竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細胞所分泌的一種糖蛋白。卵巢內的小竇卵泡數量越多，AMH的濃度便越高，反之，當卵泡隨著年齡及各種因素逐漸消耗，AMH濃度也會隨之降低。研究發現，該激素在小鼠、牛等卵巢中，由生長卵泡內的顆粒細胞特異性表達，且外周血中AMH濃度可以反映出生長卵泡的數量，對卵巢儲備的評價和超數排卵效果的預測有重要意義[4]，AMH可作為預測卵巢儲備的標志物。本研究在AMH水平與超數排卵效果的相關性分析中發現，AMH水平與回收胚胎數呈強正相關(0.7≤R<1)，與可用胚胎數也呈中度正相關關系(0.4≤R<0.7)。Monniaux等[18]對山羊的研究結果顯示，血液中AMH濃度與總胚胎數、可用胚胎數、黃體數呈顯著正相關；王立凱[4]在奶綿羊研究結果中發現，AMH與回收胚胎數、可用胚胎數均呈顯著正相關；上述結果均與本研究結果一致，表明在一定范圍內AMH濃度越高，則可能獲得更多的胚胎。

在超數排卵過程中對動物注射外源性促性腺激素，使得母羊排出更多的卵泡。外源性LH量的減少會引起胚胎回收數、可用胚胎數的增加，高劑量的LH會造成可排卵的FSH劑量的增加，并且在超排中使用高濃度的LH會導致卵母細胞發育不成熟，進而降低胚胎質量[19-20]；還有研究認為，超排時內源性LH已經足夠，不需要注射LH，而外源性FSH純化越高，則胚胎的質量越好[21]。因此，在超數排卵過程不能盲目使用促性腺激素，需要根據不同品種、不同環境等選擇適宜的超排方案，從而達到更好的超排效果。

3.3 最優回歸模型

FSH、LH和AMH作為卵泡發育及排出過程中的重要激素指標，已被報道可聯合檢測以初步評估卵巢儲備功能[22]，本研究通過逐步回歸方法建立了血清激素對回收胚胎數的最優回歸方程，模型對應R2為0.914，該值越接近1則表示模型越接近真實值[23]，反映出該回歸模型用于評估回收胚胎數的可靠性，而通過該回歸模型，根據超數排卵前供體血清激素來對回收胚胎數進行預測，可改善優質供體母羊的篩選，進而節約超數排卵成本，改善超數排卵效果。因此本研究認為，通過這3項指標的聯合檢測來評估超數排卵效果具有重要意義。

4 結論

本研究分析了薩福克羊血清激素與超數排卵效果的相關性，結果表明FSH、LH、AMH與黃體數、回收胚胎數、可用胚胎數均呈正相關關系。在超數排卵過程中，要根據具體品種、條件等設計相應超排方案，監測控制好動物體內激素水平，從而提高超數排卵效果。同時，本研究還建立了最優回歸模型：Y=-50.041+5.732X1+1.030X2-3.110X3，可利用血清中AMH、FSH與LH評估回收胚胎數。